[보고서]톡소포자충 감염에 의한 congenital anomaly 발생에 있어서 ROS 및 inflammasome의 역할 규명

이영하

[국가R&D연구보고서] 톡소포자충 감염에 의한 congenital anomaly 발생에 있어서 ROS 및 inflammasome의 역할 규명
Roles of ROS and inflammasome in the occurrence of congenital anomaly of fetus by Toxoplasma gondii infection 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	충남대학교 Chungnam National University
연구책임자	이영하
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2022-03
과제시작연도	2021
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202200015247
과제고유번호	1711142246
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-11-15
키워드	톡소포자충.선천 장애.활성산소종.인플라마좀.Toxoplasma gondii.congenital anomaly.Reactive oxygen species.Inflammasome.

초록 ▼

연구개요
톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 우리나라를 비롯하여 세계적으로 분포하는 인수공통기생충으로 신생아에게 선천 기형을 일으키지만 그 발병 기전 및 유발 인자에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구는 1)인간 태반유래 세포)를 이용하여 톡소포자충에 의한 세포사멸(cell death) 조절 기전을 규명하고자 하였고, 2)톡소포자충에 의한 세포사멸에 있어서 ROS와 inflammasome이 세포사멸의 유발 인자로서의 역할을 in vitro 및 in vivo 모델을 이용하여 평가하였다. 또한 3)선천성 톡소포자충증 마우스 모델의 배아세포(수정란)를 이용하여 세포사멸 조절기전, ROS 및 inflammasome의 역할을 분석하여 임신중 톡소포자충 감염에 의한 태아의 선천 기형 발생 기전을 이해하고자 하였다.

연구목표대비 연구결과
1차년도 연구 목표: 톡소포자충에 의한 세포사멸 기전 연구
1. 목표대비 연구 달성도: 100%
2. 연구 결과
1) 톡소포자충 감염세포에서 세포변성(독성) 유무 확인
- Lactate dehydrogenase (LDH)방법 및 형광항체법 으로 감염 태반세포의 cytotoxicity 확인.
2) 톡소포자충 감염세포에서 세포사멸의 확인
- 감염 태반세포를 면역형광항체으로 Mitochondrial membrane potential (MMP)을 확인한 결과 감소를 확인하였음.
- 또한 감염 태반세포를 Western blot 방법에 cleaved caspase-3 및 PARP 발현을 확인한 결과 모두 유의하게 증가됨을 확함.
2차년도 연구 목표: 톡소포자충에 의한 세포사멸에 있어서 ROS 및 Inflammasome의 기전 연구
1. 목표대비 연구 달성도: 100%
2. 연구 결과
3) 톡소포자충에 의한 태반유래세포의 ROS 생성 평가
- Flow cytometry 방법으로 감염 태반세포의 ROS 생산량을 조사한 결과 유의하게 증가됨을 확인함.
- 또한 ROS scavengers를 처치한 후 LDH cytotoxicity를 확인한 결과, 세포독성이 유의하게 감소함을 확인함.
4) 톡소포자충에 의한 태반유래세포의 inflammasome 생성 조사
- 톡소포자충 감염 태반유래세포에서 inflammasome아 생성되는 것을 qRT-PCR, Western blot 방법으로 확인하였다. Inflammasome 중 NLRP1, NLRP3, NLRC4 및 AIM2 등이 주로 발현되었다.
- 또한 톡소포자충 감염 인간 소장 상피세포를 이용하여 NOD-유사 수용체 및 Inflammasome의 발현 및 활성 kinetics를 조사하였디.
5) ROS 유도에 의한 다양한 형태의 apoptosis 기전을 연구하기 위하여 아래와 같은 연구를 추가적으로 더 수행하였다.
- 나노입자를 이용한 세포사멸 기전 연구
- 내강기생원충인 질편모충 감염세포의 apoptosis 기전 연구
6) 톡소포자충 감염숙주의 세포반응 연구
3차년도 연구 목표: 마우스 모델을 이용한 선천성톡소포자충증의 특성 파악
1. 목표대비 연구 달성도: 100%
2. 연구 결과
7) Congenital anomaly 발생에 있어서 ROS 및 inflammasome 역할 규명
-톡소포자충 감염 태반유래세포에서 ROS 및 inflammasome 매개 경로를 통하여 pyroptosis가 유발되었다.
8) KO cell, 인간 세포 및 실험동물을 이용한 congenital anomaly 발생에 있어서 ROS 및 inflammasome의 역할 규명
- NLRP1, NLRP3, NLRC4 and AIM2 gene knockdown 태반유래세포를 이용한 연구
- 인간 태반 융모세포(placental villi)을 이용한 연구
- NLRP3−/− 및 AIM2−/− 마우스를 이용한 toxoplasmic congenital anomaly 연구

연구개발성과의 활용계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성)
○ 선천성 톡소포자충증시 태아의 기형유발 기전을 종합적으로 규명하려는 시도는 이번 과제의 가자 큰 특징이며 중요한 점이다. 지금까지 선천성 톡소포자충증의 발병 기전에 관한 보고된 병인 연구 모두 단일세포 수준에서 연구이었다. 그러나 본 과제에서는 사람 태반세포, 태아줄기세포, 마우스의 배아세포(수정란) 및 마우스 in vivo 모델까지 모두 조사하여 선천 기형의 유발 원인을 광범위하고 종합적으로 찾으려고 노력하였다.
○ 본 과제를 통하여 선천성 톡소포자충증시 태아의 기형 유발에 있어서 그 병태생리학적 특성의 일부를 새로 밝혔다. 지금까지 선천성 톡소포자충증 연구에서 inflammasome에 대한 연구는 없었다. 본 과제에서 선천성 톡소포자충증의 유발에 있어서 Inflammasome이 관여함을 밝혔고 또한 그 작용 기전을 제시하였다. 즉, 태반세포에 톡소포자충 감염시 ROS가 유발되고, 유발된 ROS는 inflammasome을 활성화시켰고, 이는 다시 caspase 시스템을 활성화시켜 pyroptosis를 유도하였다. 이러한 결과는 본 과제에서 처음 제시된 내용으로 학술적으로 의의가 있겠다.
○ 본 연구를 통하여 선천성 톡소포자충증시 태아의 기형 유발에 있어서 ROS 및 inflammasome의 관련성을 밝혔으며, 추후 이러한 물질이 톡소포자충증의 진단, 치료 혹은 백신 후보 물질로서의 가능성을 검증할 예정이다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 11
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 11
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 14
3) 목표 달성 수준 ... 15
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 15
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 16
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 16
6. 참고문헌 ... 17
[붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 19
[붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 20
끝페이지 ... 38

표/그림 (13)

표 T. gondii infection increased the cellular cytotoxicity. (A) BeWo, HTR-8/SVneo and WISH cells were infected with the T. gondii GFP-RH strain at MOI 1, 5, 10 for 2 h, and fixed and stained with Texas Red-Phalloidin and DAPI, and then visualized by confocal microscopy. (B) The number of T. gondii-infected cells and the total number of cells were counted and the T. gondii infaction rates were calculated. (C) Cell supernatants were harvested 0, 2, 6, 12, 18 or 24 h post-infection and Lactate dehydrogenase activity (LDH) were measured
표 T. gondii infection decreased mitochondrial membrane potential (MMP) in the placental cells. JC-1 staining was observed by confocal imaging. In JC-1 stained cells, red fluorescence is visible in cells with high MMP, while green fluorescence of JC-1 monomer is present in cells with low MMP
표 T. gondii infection induced host cell apoptosis. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH cells were infected with T. gondii GFP-RH strain at MOI of 1 and 5 for 0, 2, 6, 12, 18 and 24 h
표 T. gondii induced cytosolic and mitochondrial ROS production in the placental cells. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH three kinds of placental cells were infected with T. gondii at MOI of 1 and 5 for 0, 2, 6, 12, 18 and 24 h. (A) Intracellular and (B) mitochondrial ROS levels were measured by flow cytometry after CellROX and MitoSOX staining. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three experiments. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with mock-infected control c
표 LDH cytotoxicity of placental cells after treatment of ROS scavengers. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH three kinds of placental cells were pre-incubated with the indicated concentration of N-acetyl cysteine (NAC) or mitoquinone (MitoQ) for 2 h and incubated for a further 24 h and LDH level in the supernatnant were measured. The percentage of cytotoxicity was represented as the as the mean ± SD of at least 3 independent experiments. P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, as compared to the control group
표 Induction of NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2 and ASC mRNA expression in response to T. gondii infection in three kinds of placental cells. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH cells were pre-infected with T. gondii at MOI1 or MOI5 for 0, 2, 6, 12, 18 and 24 h. Expression of indicated mRNA expression was evaluated by qRT-PCR. Each PCR reaction was carried out with three parallels. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with mock-infected control cells
표 Changes in the expression NLR and inflamasome components protein levels in response to T. gondii infection in placenta-derived cells
표 T. gondii induced the pyroptosis in the placental cells. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH cells were infected with T. gondii at MOI of 1 and 5 for 0, 2, 6, 12, 18 and 24 h. (A) The protein levels of pyroptosis related proteins were assessed using western blotting. Anti-α-tubulin was used as internal control. (B) Cells were stained with cleaved caspase-1 antibody and detected under a confocal microscope. Representative confocal images of cleaved caspase-1 expression as red fluorescence
표 T. gondii infection induced activation of inflammasomes in the placental cells. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH cells were infected with T. gondii RH strain at MOI of 1 and 5 for 0, 2, 6, 12, 18 and 24 h. (A) The protein levels of inflammasome-related proteins were assessed using western blotting analysis. (B) The IL-1β secretion levels were evaluated by ELISA
표 ROS scavenger NAC or mitochondrial ROS scavenger (MitoQ) inhibited the activation of inflammasomes and pyroptosis in T. gondii-infected placental cells. (A) Intracellular and (B) mitochondrial ROS levels were measured by flow cytometry. (C) The protein levels of inflammasome and pyroptosis related proteins were assessed using western blotting analysis. (D) The IL-1β secretion levels were evaluated by ELISA
표 NLRP1, NLRP3, NLRC4 and AIM2 gene knockdown attenuated pyroptosis in T. gondii-infected placental cells. BeWo, HTR8 SV/neo and WISH cells were transfected with control siRNA or specific NLRP1, NLRP3, NLRC4 and AIM2 siRNAs and infected with T. gondii. (A) Protein levels of inflammasome and pyroptosis related protein levels were Western blotting. (B) The IL-1β secretion levels were evaluated by ELISA
표 T. gondii induced activation of inflammasomes and pyroptosis within human placental villi. Human placental villi were isolated and freshly harvested T. gondii tachyzoites (2×105/well) were added directly to the villi culture system and infected for 24 h and 48 h. (A) The protein expression of TP3, NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2, ASC, GSDMD, cleaved caspase-1 and IL-1β levels were detected by fluorescent western blotting. (B) Expression of indicated mRNA expression was evaluated by qRT-PCR. Each PCR reaction was carried out with three parallels. **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with mock-infected control cells. (C) The protein expression of NLRP1, NLRP3, NLRC4, AIM2, cleaved caspase-1 and IL-1β in T. gondii-infected placental villi tissue was detected by immunohistochemistry
표 The impact of NLRP3 and AIM2 on abnormal pregnancy outcomes caused by T. gondii infection in mice. Uninfected mice were healthy and normal fetuses and placentas. Infected mice were lethargic, and fetuses and placentas were inflamed with hyperemia. NLRP3−/−and AIM2−/−infected mice were spiritual malaise, and showed more absorbed fetuses

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