초록 ▼

□ 연구개요
○ 본 연구에서는 Comamonas속의 균주로부터 난분해성 다량체, 리그닌의 대사산물들인 vanillate와 4-methoxybenzoate를 기질로 탈메틸화를 비롯한 대사에 관여하는 유전자와 단백질들을 stimulon 관점에서 발굴하고 각 특성과 기작을 규명하고자 하였음.
○ vanillate와 4-methoxybenzoate는 메톡시기(methoxy group)가 각각 meta와 para 위치에 존재하는 analogous 방향족 화합물임. 대상 균주의 유전체에는 vanillate와 4-methoxybenz

□ 연구개요
○ 본 연구에서는 Comamonas속의 균주로부터 난분해성 다량체, 리그닌의 대사산물들인 vanillate와 4-methoxybenzoate를 기질로 탈메틸화를 비롯한 대사에 관여하는 유전자와 단백질들을 stimulon 관점에서 발굴하고 각 특성과 기작을 규명하고자 하였음.
○ vanillate와 4-methoxybenzoate는 메톡시기(methoxy group)가 각각 meta와 para 위치에 존재하는 analogous 방향족 화합물임. 대상 균주의 유전체에는 vanillate와 4-methoxybenzoate의 탈메틸화에 관여할 것으로 예측되는 세 개의 paralog가 존재하였으며 각각의 단백질들은 기질에 특이적으로 작용할 것으로 예측되어 이에 대한 기작을 밝히고자 하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
Plasposon을 이용하여 무작위 돌연변이를 제작하였고 ferulate와 4-methoxybenzoate을 각각 단일 탄소원으로 이용하지 못하는 2종의 돌연변이 균주를 선발하였음. 돌연변이 N20 균주에서 전이인자가 삽입된 위치는 vanillate demethylase와 상동성을 보였으며, N28 균주에서 삽입된 위치는 Rieske iron-sulfur protein과 상동성을 보였음. 4-methoxybenzoate와 vanillate를 단일 탄소원으로 모두 이용하지 못하는 C. testosteroni P19 돌연변이들의 결실유전자를 추적한 결과, alcohol dehydrogenase 유전자, carboxyesterase 유전자가 대사과정에 관여하는 것으로 분석되었음. 결실유전자들이 암호화하고 있는 demethylase들은 4-methoxybenzoate와 vanillate에 대해 각각 기질특이성을 가지고 있는 것으로 판단된 반면, dehydrogenase와 carboxyesterase는 기질특이성이 상대적으로 넓어 두 대사경로에 모두 관여하는 것으로 분석되었음.Comamonas testosteroni strain P19의 genome에는 3개의 vanA 유전자와 2개의 vanB 유전자가 존재하며 vanA1과 vanB1 그리고 vanA3와 vanB2는 오페론 구조로 구성되어 있었음. 각 유전자들의 기질 특이적 발현을 알아보기 위해 RNA-seq, 단백질체 분석, qRT-PCR을 실시하였음. 그 결과, 오페론 구조의 vanA3와 vanB2는 4-methoxybenzoate가 단일 탄소원으로 제공되었을 때 특이적으로 발현이 유도되었음. 반면에 vanA2는 ferulate가 단일 탄소원으로 제공되었을 때 특이적으로 발현이 유도되었음. vanB1은 vanA1과 오페론 구조를 구성하고 있으며 4-methoxybenzoate와 ferulate가 단일 탄소원으로 제공되었을 때 모두 발현이 증가되었음. 이것은 vanA2와 vanB1이 복합체를 구성하여 ferulate의 탈 메틸화를 촉매한다는 것을 의미함.
결론적으로 Comamonas testosteroni strain P19에서 메톡시 기의 탈메틸화 작용이 meta와 para 위치에 따라 다른 탈메틸화 효소가 관여하였으며 두 탈메틸화 작용은 서로 다른 vanA와 vanB 유전자로 암호화되어 있는 산화환원 효소들에 의해 촉매된다는 것이 규명되었음. RNA-seq 및 단백질체 분석, qRT-PCR을 통해 meta 위치의 탈메틸화는 VanA2-VanB1이 관여하고 para 위치의 탈메틸화는 VanA3-VanB2가 관여한다는 것이 밝혀졌음.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
○ 탈메틸화 유전자 및 단백질에 대한 연구는 Pseudomonas, Rhodococcus 등에서 수행되었으며 탈메틸화 단일 과정을 거쳐 산화됨으로서 메톡시기가 OH기로 치환된다고 알려져 있음. 그러나 본 제안서의 선행연구 결과를 보면 좀 더 복잡한 대사과정일 가능성이 제기되었음. 따라서 본 연구를 통해 신규 대사경로를 확인할 수 있었으며 새로운 과학적 지식을 보급할 것으로 기대됨.
○ 본 연구를 통해 획득된 유전자 정보를 바탕으로 유전자 소재로 발굴할 수 있으며 이들을 이용하여 생촉매 연구에 활용할 수 있을 것으로 기대됨. 또한, 이를 통한 환경친화적 바이오화합물 생산과 같은 고부가가치 산업에 활용도 가능할 것으로 사료됨.
○ 또한, 응용된 소재의 특허화를 통해 지식재산권을 확보함으로서 가치창출을 기대할 수 있음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• 1. 돌연변이 및 전장유전체 분석 ... 5
• 2. P19에 존재하는 vanA 유전자 분석 ... 7
• 3. vanA 유전자의 operon 구조 분석 ... 8
• 5. Global transcript profiles과 differential gene expression 분석 ... 9
• 6. P19에서 vanA-vanB의 RNA 양 분석 ... 11
• 7. P19 protein profiling 분석 ... 12
• 8. 단백질 수준에서 vanAB 발현 분석 ... 14
• 9. qRT-PCR ... 15
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 16
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 16
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
• 3) 목표 달성 수준 ... 17
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 17
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 18
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
• 6. 참고문헌 ... 18
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 20
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 21
• 끝페이지 ... 21