[보고서]페니바실러스 폴리믹사균의 표현형 변이 기작 연구

전용호

[국가R&D연구보고서] 페니바실러스 폴리믹사균의 표현형 변이 기작 연구
Study on the molecular mechanism of phenotypic variation in Paenibacillus polymyxa 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	안동대학교 AnDong National University
연구책임자	전용호
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2022-03
과제시작연도	2021
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202200016401
과제고유번호	1711144959
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-11-22
키워드	페니바실러스 폴리믹사.표현형 변이.생물농약.내생포자.후성유전학.Paenibacillus polymyxa.Phenotypic variation.Biopesticide.Endospore.Epigenetics.

초록 ▼

□ 연구개요
생물농약으로써 산업적 이용가치가 높은 유용미생물인 Paenibacillus polymyxa E681 균에서의 표현형 변이의 발생 경로를 유전적 및 후성유전적 수준에서 구명하고, 이를 통해 지속적으로 이용 가능한 미생물농약 개발의 원천기술을 확보하고자 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
❍ P. polymyxa E681균의 표현형 변이(PV) 특성 분석 완료
❍ PV 관련 유전자 리스트 확보
- Sporulation 관련 key 유전자로서, abr 및 soj 확보
- Flagella 및 chemotaxis관련 유전자 발현 분석
- Carbohydrate metabolism과 변이체의 생장특성과의 상관관계 확인
- Purine metabolism, riboflavin metabolism과의 관련성 확인
❍ PV 조절 유전자의 형질전환체 구축 및 변이기작 연구
- Mini-Tn10 transposon을 이용한 형질전환체 확보
- 변이가 발생하지 않는 조건 구축
❍ P. polymyxa의 PV관련 후성유전학적 연구 및 종합적분석
- 5′-azacytidine을 이용한 epigenetic change 발생 확인
- PV의 조절방법 제시

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성)
❍ 생물농약 시장의 높은 성장률에도 불구, ‘유용미생물의 PV 연구’는 산업체에서하기 힘든 기반 연구임. 생물농약개발시 변이발생연구는 사전연구로 반드시 필요함.
❍ PV 발생은 자연계에서 빈번하게 발생하며 이는 유용 미생물의 효과와 직결됨. 변이발생 메커니즘 이해와 조절에 대한 연구결과는 생물농약개발자들에게 중요한 정보가 될것임.
❍ 기존 연구결과에 메커니즘 연구가 추가되면 세계적인 기술수준 확보 가능함. 학계뿐 아니라 생물농약 개발자, field에서 안정적인 효과를 기대하는 농민, 친환경농산물에 대한 니즈가 있는 소비자에게 기여할 수 있을 것으로 판단됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
II. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
1. P. polymyxa E681 균에서 표현형 변이 (PV)의 유전적 경로 구명 ... 5
II. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 15
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 15
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 16
3) 목표 달성 수준 ... 16
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 16
III. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 16
IV. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 16
V. 참고문헌 ... 18
붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 19
붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 20
끝페이지 ... 26

표/그림 (23)

표 Final goal of the current research. Phenotypic variation lead to unexpected unequal and/or ineffective disease control activity of useful microorganisms, such as P. polymyxa E681. Mechanistic understandings on phenotypic variation at the 1) genetic, 2) proteomic and 2) epigenetic levels assets to developing a novel biological control agent
표 Differential character-istics of P. polymyxa E681 ‘B’ and ‘F’ types that is induced by phenotypic variation. (a) Distinct colony shape, (b) lack of endospore formation, (c and d) enhanced number of flagella cell motility, (e-i) reduced antimicrobial activity, and (j-i) impaired root colonization of ‘F’ type
표 DEGs related with sporulation deficiency. Sporulation is suppressed at stage 0 in F-type
표 Bacterial cell growth at different duration of time. The growth curves of two types of E681, wild type (B-type; A) and phenotypic variant (F-type; B) were tested for growth population. The conversion of B-type to F-type starts on the 3rd day after incubation at 30C (C), and when F-type cultured onto TSB, did not show any variation until seven days (D). All colonies were of only F-type. (E) The cell doubling time of B- and F-types at different temperatures. Results represent means ± SD from duplicated independent experiments. Each experiment contains three replicates and the experiment was repeated at least once with similar results.
표 Metabolic acitivity and biochemical characteristics between B- and F-type
표 Downregulation of sporulation-related genes in F-type cells and a proposed model for sporulation is regulated. (A) The interactions between the genes likely to be expressed in sporulation stage 0 and regulatory genes. The STRING map of proteins expressed in sporulation stage 0. Line shape indicates the predicted mode of action. The thickness of the yellow arrows in each node represents the log2 fold changes of each gene by RNA-seq. The upward-pointing arrow indicates upregulation and downward direction indicates downregulation in F-type. A circle without a yellow arrow indicates no difference in the amount of expression between B- and F-types. Blunt ended arrows represent negative interaction. (B) A simplified schematic representation of the regulatory network that governs the initiation of sporulation in E681. Yellow represents key regulators of Spo0A. (C) The interaction network between kinases and Spo0F in E681 based on string analysis is shown. Line thickness indicates the strength of data support
표 Oligonucleotide primer sets used for the study
표 kinase관련 유전자발현
표 Upregulation of E681 genes likely involved in motility. Most genes related to flagella assembly (A) and bacterial chemotaxis (B) were overexpressed in F-type. The E681 genes are marked red boxes. The genes in uncolored boxes were not found in E681. The blue numbers are the gene IDs, with ‘PPE_RS’ omitted in front. The diagrams were adopted from the original KEGG pathway ppy02040 (A) and ppy02030 (B)
표 Upregulation of E681 genes involved in predicted carbohydrate metabolism. (A) Citrate cycle (TCA cycle) in F-type. The genes in E681 were marked red and all the genes were overexpressed in F-type. The graphic is adapted from the original KEGG pathway (ppy00020). (B) Mannose PTS encoded by manXYZ
표 Upregulation of E681 genes and proteins involved in purine metabolism in F-type. The graphic is adapted from the original KEGG pathway (ppy00030). Yellow line means M00043 module (inosine monophosphate biosynthesis), all overexpressed in F in RNA-seq. Fold change is shown in blue. The red line shows the function of IUNH overexpressed in F-type in 2DE
표 Upregulation of E681 genes and proteins involved in riboflavin metabolism in F-type. The graphic is adapted from the original KEGG pathway. Yellow line means up-regulated genes in RNA-seqand red line means up-regulated protein in 2DE in F-type. Fold change is shown in blue
표 Mini-Tn10을 이용한 random mutagenesis. Em+배지에서는 생장하지 못하나 Sp+배지에서 는 잘 자라는 콜로니를 선발하는 과정
표 Effect of culture media on phenotypic variation
표 The occurrence of phenotypic variation according to the temperature (A) The phenotypic variation of B-type cells observed at various temperatures and incubation times. (B) The bacterial growth and population of B-type cells at different temperatures and durations of times for mass production
표 Effect of carbon source on colony morphologies of ‘B’ and ‘F’ types.(a) The colony morphology of ‘F’ was similar to ‘B’ in PDK medium, but endospores were not produced from ‘F’ type. (b) Phenotypic variant colony ‘F’ varied in colony morphology depends upon dextrose content in the solid medium. When the dextrose content increased, the ‘F’ colony was formed in dense and convex shape on the center. The variant ‘B’ type also appears to be varied in morphology in comparison with the colony which cultured without an addition of dextrose
표 (a) Chemical structure of 5’-azacytidine (b) Reduction of endospores by AZA concentration in the medium (c) Microscope photos. B changed into sporulation-deficiency by adding 5-azacytidine. In ‘B+AZA’ treatment, B didn’t form endospores for 4 days. F had no change in sporulation ability. It could still not make endospores with and without 5-azacytidine
표 Cell elongation by AZA
표 Growth curve of AZA-treated E681 그림 17. Electrophoregram of total DNA samples before and after HpaII or MspI treatment
표 Reversion of AZA inhibition by Adenosine and Uracil
표 Electrophoregram of total DNA samples before and after HpaII or MspI treatment
표 Electrophoregram of total DNA sample after DpnI or DpnII treatment
표 Effect of AZA on endoporeproduction. (a) Endospores are reduced as 5’-azacytidine (AZA) concentration increases in the medium. (b) Chemical structure of 5’-azacytidine. (c) Microscopic observations on sporulation- deficiency by AZA. Sporulation was inhibited in ‘B’ when treated with AZA until 4 days. F type had not change in sporulation ability, and bacteria was elongated when treated with AZA

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