초록 ▼

□ 연구개요
○ 미생물을 이용한 식물유래 천연물을 생합성할 경우 여러 단계의 효소 반응을 필요로 하며, 따라서 미생물 내에서 ~수kb급/10kb급 DNA의 안정적인 유전자 발현시스템이 필요하며, 이를 가장 효과적으로 구현하는 수단으로 게놈에 직접 유전자를 삽입하는 방식이 사용됨.
○ 현재까지 코리네박테리움에서 사용되는 게놈 유전자 삽입법은 Cre-loxP 삽입법이나 sacB gene을 이용한 두 단계의 상동 유전자 재조합 방식을 이용하나 이 방법은 특히 코리네박테리움에서 세포 독성이 커 kb급 DNA의 삽입 효율이 낮고

□ 연구개요
○ 미생물을 이용한 식물유래 천연물을 생합성할 경우 여러 단계의 효소 반응을 필요로 하며, 따라서 미생물 내에서 ~수kb급/10kb급 DNA의 안정적인 유전자 발현시스템이 필요하며, 이를 가장 효과적으로 구현하는 수단으로 게놈에 직접 유전자를 삽입하는 방식이 사용됨.
○ 현재까지 코리네박테리움에서 사용되는 게놈 유전자 삽입법은 Cre-loxP 삽입법이나 sacB gene을 이용한 두 단계의 상동 유전자 재조합 방식을 이용하나 이 방법은 특히 코리네박테리움에서 세포 독성이 커 kb급 DNA의 삽입 효율이 낮고 유전자 조작이 상대적으로 번거로움.
○ 이를 극복하기 위해 수kb급~10kb급 DNA를 효율적으로 코리네박테리움의 원하는 위치에 삽입할 수 있는 기술이 필요함.

□ 연구 목표대비 연구결과
◎ 연구 목표
○ 바이오파운드리**용 멀티 유전자 어셈블 리가 적용 가능한 벡터 플랫폼 개발 및 유전자 삽입 벡터 개발
○ 항생제마커가 없는 타겟 지향적 코리네균주*용 CRISPR-Tn (Tn6677+Cas8,7,6,TniQ) 기반 고효율 벡터시스템 개발 및 삽입 효율 검증, 삽입 특성 분석.
○ 대사공학적 적용을 위해 알려진 서브-대사경로급 유전자 삽입 실증
○ 산업적으로 사용되는 코리네균주 유전체 내의 유전자 삽입용 Hotspot에 대한 원천연구
*코리네박테리아 종으로 산업용 아미노산 및 저칼로리 당을 생산하는 균
**바이오파운드리: 규격화된 바이오소재, DNA, 미생물 조작을 위한 96웰 기반 자동화 로봇 플랫폼(기 보유)

◎ 연구 결과
○ Tn6677 CRISPR-Cas시스템의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주용 최적화를 위한 crRNA디자인, Bglbrick 방법, 골든게이트 클로닝방법을 활용하여 코리네박테리움용 TniQ-Cascade 시스템 개발 완료

○ 코리네박테리움에 최적화된 CRISPR-Cas의 발현을 통해 crRNA로 지정한 코리네박테리움 게놈 상에 3kb 급의 유전자가 삽입되는 것을 확인함.

○ 골든게이트 제한 효소(BsaI) 사이트를 pDonor에 도입하여 멀티DNA어셈블리 기술이 활용될 수 있어 바이오파운드리에 적용 가능하며 반복적인 균주개량에 적합함.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
○ 본 연구를 통해 얻을 것으로 기대하는 코리네박테리움용 Tn6677-CRISPR-cas-기반 유전자 삽입 도구는 수kb~10kb급 이상의 유전자 클러스터의 효율적이고 안정적인 발현을 기대할 수 있으며, 발효공정 중 타겟 DNA를 잃어버릴 염려가 없음.

○ 플라스미드 상에서 발현되는 유전자와 달리 항생제와 같은 마커를 사용할 필요가 없어 보다 유전자 삽입의 과정이 단순해질 수 있으며, 항생제내성의 문제를 향후 야기시키지 않음.

○ 본 연구는 DNA 삽입을 타겟하는 위치인 스페이서와 삽입될 DNA 조각을 제한작용과 접합작용이 one-pot에서 수행될 수 있는 골든 게이트 에셈블리 방식을 사용하므로 향후 본 연구실의 바이오파운드리와 연계한 연구에 적용될 수 있음.

○ TniQ시스템의 경우, 바이오파운드리 및 유전자 어셈들리기술과 시너지를 내어 고속으로 다양한 대사경로를 구현할 수 있는 기초 도구로 활용될 수 있음. 향후 신규 고부가 식물 유래 천연물 생산용 대사경로 적용 가능

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 10
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 10
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 11
• 3) 목표 달성 수준 ... 11
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 11
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 12
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 13
• 6. 참고문헌 ... 13
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 15
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 17
• 끝페이지 ... 23