[보고서]FISH 기법에 의한 결명자 유전체 내 반복서열 및 단일서열의  물리지도 작성

김현희

FISH 기법에 의한 결명자 유전체 내 반복서열 및 단일서열의 물리지도 작성
Physical mapping of repeat and single sequences of Senna tora (L.) Roxb. by FISH technique 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	삼육대학교 SahmYook University
연구책임자	김현희
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2021-03
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202200018079
과제고유번호	1711114608
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-12-05
키워드	결명자.유전체.반복서열.FISH기법.물리적 지도.Senna tora.Genome.Repeat sequence.FISH technique.Physical map.

초록 ▼

□ 연구개요
표준유전체 정보가 밝혀진 주요 약용식물 결명자(Senna tora (L.) Roxb.)의 유전체 내
특이 및 비특이 repeat 서열을 분리, 동정하고 이들 서열의 유전적 다양성과 유사 서
열 간의 반복 수의 차이에서 나타나는 유전적 다형성을 밝힘과 아울러 결명자 속 국외
종들을 수집하여 각 종에서 나타난 특이적 반복서열의 유전체 내 분포와 빈도를 비교
하고 multi-color FISH 기법에 의한 핵형분석으로 염색체 수준에서의 종 특이성 및 종
간 유연관계를 확립하였음
● 1~2년차: Whole genome sequencing 자료로부터 유전체 내 각종 반복서열 탐색,
분석 및 주요 반복서열에 의한 FISH 핵형분석
● 2~3년차: 각종 반복서열에 대한 oligo-probe 개발 및 단일서열 probe cocktail에
의한 chromosome painting으로 염색체 내 분포 및 위치 규명
● 3~4년차: Multi-color FISH 기법에 의한 각종 반복 서열의 chromosome painting
과 physical mapping 및 rDNA 유전자 단일서열에 의한 종 특이성 규명 및 계통
유연관계확립

□ 연구 목표대비 연구결과
1. 연구목표
1) Whole genome sequencing 자료로 부터 유전체 내 각종 반복서열 탐색, 분석 및
주요 반복서열에 의한 FISH 핵형분석
2) 각종 반복서열에 대한 oligo-probe 개발 및 단일서열 probe cocktail에 의한
chromosome painting으로 염색체 내 분포 및 위치 규명
3) Multi-color FISH 기법에 의한 각종 반복 및 단일서열의 chromosome painting 및
physical mapping으로 종의 유전체적 특이성을 규명하고 종간 유연관례를 확립함
2. 연구결과
1) 결명자 국내종 각종 반복서열의 분리, 동정, 분석, 결명자의 염색체 표본제작 및
FISH 핵형분석을 실시하였고 결명자속 외국종 종자를 확보하여 연구범위를 확대함
2) 결명자 유전체 내 주요 반복서열들을 발굴하고 이에 대한 pre-labelled oligo
probe를 개발하여 결명자 유전체 반복서열의 염색체 내 분포 및 위치를 규명함
3) Multi-color FISH 기법을 개발하고 5S와 45S rDNA 및 말단 반복서열을 탐침으로
국내 및 외국종 결명자 염색체 FISH 물리지도를 작성하고 rDNA 유전자 관련
단일서열 분석으로 종간 유연관계 추적이 진행되고 있음

□ 연구발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
1) 기술적 측면
- 결명자 주요 반복서열 oligo-probe 개발; 일반적인 FISH hybridization 시간을
16시간에서 1시간으로 단축시키고 incubator 대신 상온에서 혼성화하여도 효율을
높일 수 있는 FISH 기법을 개발하여 FISH분석관련 연구에 기여
- Multi-color BAC FISH 기법의 개발로 결명자의 물리적 지도 작성에 유용한 정보를
제공하고 분자적 연구 결과에 정확성을 부여함
- 하나의 염색체 슬라이드에 1개 또는 2개의 BAC의 위치를 탐색하는데 이용되었던
기존의 방법에 2개 이상의 BAC clone을 multi-color로 적용하여 물리지도 작성시
시간의 BAC library screening 시간을 단축하고 결과의 가치를 고양시킴
2) 산업적 측면
국내 순계 결명자(명윤결명) 뿐만 아니라 여러 나라의 결명자 종의 유전, 육종을
위한 체계적인 분자세포유전학적 육종 정보를 제공하여 주요 약용식물인 결명자솟
식물의 개발 및 산업화로 활용될 수 있음

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 5
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 5
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
3) 목표 달성 수준 ... 17
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 17
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
1) 결과의 의미 ... 18
2) 기술적 측면 ... 18
3) 산업적 측면 ... 18
6. 참고문헌 ... 19
붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 20
붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 28
끝페이지 ... 40

표/그림 (19)

표 List of Senna species collected with their source and chromosome number
표 Triple-color FISH karyotype analysis of 23 Senna species.
표 Triple-color FISH metaphase spread of 10 Senna species: S. bauhinioides (A), S. candolleana (B), S. didymobotrya (C), S. leandrii (D), S. multiglandulosa (E), S. occidentalis (F), S. spectabilis (G), S. sulfurea (H), S. tora (I), S. viarum (J). Each species has only one 5S rDNA (green) homologous pair, while 45S rDNA (red) number varies. Most telomeric signals (yellow) hybridized on termini and additional signals on interstitial or para-, peri-centromeric region in species (F, I) Scale bar=10 μm
표 Triple-color FISH of 11 Senna species. The predominant chromosome number was 2n = 28. The exceptions were S. marilandica and S. uniflora which have 2n = 22 and 2n = 24, respectively. One pair of 5S rDNA (green) and one to three pairs of 45S rDNA (red) were detected. Scale bar=10 μm
표 FISH karyogram of ten Senna species: S. bauhinioides (A), S. candolleana (B), S. didymobotrya (C), S. leandrii (D), S. multiglandulosa (E), S. occidentalis (F), S. spectabilis (G), S. sulfurea (H), S. tora (I), S. viarum (J). Scale bar=10 μm
표 FISH karyogram of the 11 Senna species. Green, red, and blue signals indicate 5S rDNA, 45S rDNA, and telomeric repeats, respectively. Yellow arrowheads point to ITR signals. The white arrowhead points to the hemizygous 45S rDNA locus in S. auriculata. Scale bar =10 μm
표 Idiogram of the 11 Senna species. Red, green, and blue bars represent 45S rDNA, 5S rDNA, and telomere repeat, respectively
표 DNA repeats identified in the Senna tora genome listed by GP and type of repeat
표 Cluster graph layout and chromosomal distribution of the 10 independent repeats. The upper panel shows the read cluster graphs of the six tandem repeats and two LTR retrotransposon fragments. The lower panel shows the chromosomal distribution of the eight repeats from the upper panel and the rDNA families. Bar = 10 μm
표 Mitotic metaphase FISH karyogram of S. tora. A) Chromosomal distribution of the 10 independent REs showing mostly centromeric and pericentromeric localization. StoTR01_86 localized at paracentric regions of either short or long arms, except for chromosomes 4 and 11 which showed pericentric localization. StoTR02_7_tel showed extra-telomeric signals at the centromere and interstitial regions of either, but not both, chromosome arms (orange arrows). StoTR03_178 localized at centromeres of all chromosomes and at a weak locus in 7L which colocalized with StoTR05_180 (pink arrows). StoTR04_55 localized at pericentromeric regions in all chromosomes and a weak locus in 1L. StoTR05_180 was intense in the centromere of chromosome 2. Aside from centromeric regions, it was also observed at equilocal sites in the interstitial regions of some chromosomes (green, white, and pink arrows). StoTR06_159 showed an intense signal at the NOR site in chromosome 2S and a weak signal in chromosome 3S. StoLTR_2721 showed dispersed distribution at pericentromeric regions of most chromosomes, but it was more intense in chromosomes 1L and 2S NOR site. StoLTR_1468 localized centromeric regions and a weak signal at 1L. One locus each was observed for the 45S and 5S rDNA families. Some chromosomes have inherent DAPI bands (yellow arrows). Note the colocalized StoTR06_159 and StoLTR_2721 signals at the NOR site in chromosome 2S. Whereas StoLTR_1468 localized at the proximal end of the NOR site. White arrows indicate weak signals. Bar = 10 μm. B) Karyotype idiogram of S. tora with stretched (peri)centromeric region. Chromosomal niches of different repeats are indicated by different colors and patterns. The dark grey background indicates the DAPI counterstain
표 Sequence organization of the 45S (A) and 5S (B) rDNA sequences in S. tora. A) 10,235 bp S. tora 45S rDNA consensus sequence in chromosome 2. The StoIGSDR_463 (yellow arrows) was localized immediately downstream of the StoIGSTR_188 repeat arrays. Mapping of 2.7× short reads (gray graph) revealed an extreme mapping abundance of the StoIGSTR_188 coincidentally matching with the StoTR06_159 PLOPs (red bars). B) 181 bp 5S rDNA in chromosome 12. The numbers on top indicate the bp lengths of corresponding fragments. Scales are in A and B are in kb and bp, respectively
표 Sequence alignment of StoIGSTR_188 and StoTR06_159. Two complete StoIGSTR_188 from the 45S rDNA IGS region and the StTR159 consensus are shown. A total of 29 bp from three regions (nt 4-12, 41-50, and 82-91) were deleted in StTR159. The FISH targets of StoTR06_159_OP1 and StoTR06_159_OP2 are shown in yellow and blue highlights, respectively. The green highlight shows the overlapping regions between targets of StoTR06_159_OP1 and StoTR06_159_OP2 but because each probe is strand-specific, they do not compete for target DNA
표 Chromosomal distribution of the DNA repeats identified in the Senna tora genome
표 Summary of distribution of the Senna repeats in the 13 Senna tora chromosomes
표 Hypothetical pathway for chromosome dysploidy in S. tora. A) Comparative FISH of StoTR02_7_tel, StoTR05_180, and StoTR03_178 between S. occidentalis and S. tora. StoTR02_7_tel and StoTR05_180 colocalized at chromosome termini and interstitial regions (white arrowheads) in S. occidentalis with some chromosomes showing differential abundance (yellow arrowheads). Both repeats were localized at pericentric and interstitial regions in S. tora. StoTR03_178 was observed only in S. tora. Bar = 10 μm. B) Hypothetical chromosome evolution in S. tora attempts to explain the amplification of and StoTR02_7_tel and StoTR05_180 at pericentromeric and interstitial sites and the emergence of a novel StoTR03_178 centromeric repeat. Dysploidy and non-dysploidy mechanisms revert the chromosome number to n = 7 after a WGD. A second, more recent WGD triggers concerted evolution of StoTR03_178, displacing StoTR05_180 distally from the centromere. Two chromosomes merged forming a derivative chromosome (Chr. 7) causing the extant descending dysploid S. tora karyotype. Chromosomes not involved in a particular process are faded to emphasize chromosome rearrangements events
표 FISH of S. tora TRs on root metaphase chromosomes of the nine Senna species. Six of the eight
표 FISH karyogram of the root metaphase chromosomes of the nine Senna species. StoTR01_86 were mostly colocalized at 45S rDNA sites in all species except S. siamea. StoTR05_180 was at subtelomeric sites in all species except in S. sulfurea, where it localized at pericentromeric regions. The white arrows indicate the ITR in S. candolleana, S. corymbosa, S. floribunda, S. occidentalis and S. multiglandulosa. The orange arrow shows the weak signal of StoTR01_86 in S. didymobotrya. For karyogram of each species
표 Karyotype idiogram showing the distribution of S. tora TRs in nine Senna species. Note the colocalization of StoTR01_86 and StoTR06_159 at the 45S rDNA loci in some species, and the unique distribution of StoTR05_180 at the pericentromeric regions of all chromosomes in S. sulfurea, contrary to subtelomeric location in other species
표 Cyto-phylogenetic analysis among Senna species. The ten species, including S. tora, were grouped into four (I-IV). StoTR05_180 at the subtelomeric site is shared in all ten, and likely the primitive distribution pattern in, Senna. StoTR01_86 was shared by species in Groups II-IV. Independent chromosomal rearrangements involving several repeats and chromosomes have taken place in species Groups II-IV. Species in Group IV shared rearrangements involving the displacement of StoTR05_180 to the pericentromeric regions of chromosomes (pink box)

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