초록 ▼

□ 연구개요
⦁ 최근 차세대 NGS 시퀀싱을 이용한 WES (whole-exome sequencing) 및 WGS(whole-genome sequencing)와 같은 새로운 기술이 사용됨에 따라 알츠하이머(AD) 환자에서 희귀한 돌연변이가 많이 발견되고 있음.
⦁ 발견된 신규 돌연변이는 컴퓨터를 사용, bioinformatic 기법들을 도입 돌연변이들이 병원성 인지 예측 할 수 있음.
⦁ 그러나 bioinformatic 방법만으로 임상, pathology, 특성 연구를 대체할 수 없음.
⦁ 이를 보완할 수 있는

□ 연구개요
⦁ 최근 차세대 NGS 시퀀싱을 이용한 WES (whole-exome sequencing) 및 WGS(whole-genome sequencing)와 같은 새로운 기술이 사용됨에 따라 알츠하이머(AD) 환자에서 희귀한 돌연변이가 많이 발견되고 있음.
⦁ 발견된 신규 돌연변이는 컴퓨터를 사용, bioinformatic 기법들을 도입 돌연변이들이 병원성 인지 예측 할 수 있음.
⦁ 그러나 bioinformatic 방법만으로 임상, pathology, 특성 연구를 대체할 수 없음.
⦁ 이를 보완할 수 있는 방법이 CRISPR/Cas9임. 최근 CRISPR/Cas9의 시스템이 발달함에 따라 세포, 조직 및 동물에서 유전자 편집을 기존보다 쉽게 적용 가능.
⦁ 우리는 CRISPR/Cas9를 사용해 AD환자에서의 돌연변이 유전자를 도입한 세포를 제작해 여러 functional study나 pathology 연구를 진행하고 있음.

□ 연구 목표대비 연구결과
⦁ AD 환자에서 찾은 돌연변이 세포를 제작하기 위해 CRISPR/Cas9 기술을 활용함.
⦁ CRISPR/Cas9 기술은 plasmid를 이용하지 않고 DNA sequence를 치환하여 원하는 돌연변이만을 생성하도록 Cas9 단백질과 guideRNA(gRNA)를 사용하는 3세대 유전자 편집 기술임.
⦁ 본 실험실에서는 준비된 gRNA와 donorDNA를 electrophoration방식으로 Transfection 진행하여 실험을 최적화함.
⦁ 그 결과 APP-V604M은 CRISPR/Cas9을 통해 transfection에 성공한 세포를 만듦. 제한효소 및 Sanger sequencing으로 확인함.
⦁ 이 세포를 통해 AD관련 여러 biomarkers (Aβ 42, Aβ 40, P-tau, Total tau, Aβ oligomer)를 이용한 pathology 실험을 진행했고 유의미한 결과를 얻을 수 있었음. 위의 biomarkers를 통하여 돌연변이의 병인성을 In vitro에서 검증함.
⦁ PSEN1-T116I와 PSEN1-T119I 그리고 PSEN2-H169N의 경우 CRISPR/Cas9 실험을 위하여 gRNA을 디자인 하고 Cas9 단백질과 결합하여 transfection을 진행.
⦁ HEK 293세포에 돌연변이 유전자를 삽입하고 cloning이 정상적으로 수행되었는지 제한효소를 통해 검증함.
⦁ Single cell clonal isolation을 진행 이후 isolation된 세포를 Sanger sequencing으로 염기서열을 확인하는 과정에서 정상 PSEN1, PSEN2 유전자를 가진 것으로 나타나 계속 cloning이 된 세포를 분리하고 추적 중.

□ 연구개발결과의 중요성
⦁ 본 연구의 가장 큰 의미는 CRISPR/Cas9 기술을 돌연변이 세포 제작하는 데 적용하여, 돌연변이의 병인성을 In vitro에서 검증가능하게 했다는 점임.
⦁ 즉 CRISPR/Cas9 기술을 통한 돌연변이 세포주 제작은 돌연변이 유전자의 병원성을 이해하는 데 도움이 될 수 있음.
⦁ CRISPR/Cas9실험 방법을 통해 EOAD와 관련된 돌연변이 유전자, LOAD 관련 돌연변이 유전자를 가진 세포를 제작하여 AD 관련 biomarkers를 이용한 연구를 손쉽게 진행할 수 있음.
⦁ 더 나아가 돌연변이 세포가 아닌 돌연변이 마우스를 제작해 in vivo환경에서 치료제의 효과를 보거나 Aβ aggregation 정도를 확인하는 등의 실험이 가능할 것으로 예상됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 가. 연구개발의 필요성 ... 4
• 나. 가설 및 최종목표 ... 5
• 다. 연구범위 ... 6
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 7
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 12
• 가. 연구결과의 중요성 ... 12
• 나. 연구결과 의미 ... 13
• 4. 참고문헌 ... 14
• 5. 연구성과 ... 16
• 대표적 연구실적 ... 19
• 끝페이지 ... 34