초록 ▼

2020년초부터 우리나라와 전세계에 유행하고 있는 신종코로나바이러스에 대한 고감도 신속 현장 진단제를 개발하고자 하였다. 항원과 항체 면역반응을 이용한 현장 진단이 가능한 Rapid Diagnostic Test (RDT)와 함께 핵산증폭반응이 매우 빠른 등온핵산증폭법인 Recombinant Polymerase Amplification (RPA)을 이용하여 검사 현장에서 신속하고 간단하게 진단할 수 있는 고감도 진단제를 개발하였다. RPA법은 RT-PCR법과는 달리 핵산의 순도가 중요하지 않아 실험실과는 다른 현장에서의 초간단 핵산

2020년초부터 우리나라와 전세계에 유행하고 있는 신종코로나바이러스에 대한 고감도 신속 현장 진단제를 개발하고자 하였다. 항원과 항체 면역반응을 이용한 현장 진단이 가능한 Rapid Diagnostic Test (RDT)와 함께 핵산증폭반응이 매우 빠른 등온핵산증폭법인 Recombinant Polymerase Amplification (RPA)을 이용하여 검사 현장에서 신속하고 간단하게 진단할 수 있는 고감도 진단제를 개발하였다. RPA법은 RT-PCR법과는 달리 핵산의 순도가 중요하지 않아 실험실과는 다른 현장에서의 초간단 핵산 추출법으로 준비한 핵산으로도 반응이 가능한 장점이 있다. 본 연구에서 선정한 Arcis Sample prep kit로 검체의 전처리과정을 30분에서 3분으로 1/10로 줄여도 RPA반응뿐만 아니라, RT-LAMP, real time RT-RPA까지 반응이 잘되었다. 본 반응인 핵산증폭반응은 TwistDx사가 개발 시판하는 nfo kit를 이용하여 37℃에서 20분간 실시하였다. 반응이 끝난 시료는 lateral flow detector에서 2분내에 결과분석이 가능하다. 현장에서 검체처리부터 결과 분석까지 총 25분이면 가능하여 민감도가 낮은 RDT를 대체할 수 있는 방법임을 확인하였다. RPA반응에 가장 잘 반응하는 유전자 부위를 선택하기 위하여, Orf1a, E gene, RdRp 유전자에 대한 프라이머/프로브세트를 디자인하여 비교 평가한 결과, Orf1a가 가장 좋은 반응을 보였고, 67,000개 신종코로나바이러스 유전자와 100%일치하여 real time RT-RPA kit와 RT-RPA LFD kit에 사용하였다. real time RT-RPA의 분석적 한계는 0.1pg으로, 분석적 민감도는 1x10²/ul 까지였다. RT-RPA LFD kit는 분석적 한계는 0.1 fg이며, 분석적 민감도는 1x10²/ul 까지였고, rivavidin, immunogloblin, dexamethason, mucin, bovine serum albumin등에도 간섭받지 않고 반응이 잘 일어났다. 또한 Adenovirus, Human Rhinovirus, Human Bocavirus, Human Enterovirus 등에는 반응하지 않았다. 식약처 허가를 받기위한 분석적 특이도(교차), 정밀도(반복성), 정밀도(재현성), 정확도, 교차오염, 등의 분석에 모두 좋은 성적을 거두었다. IRB승인을 얻어 전북대에서 실시한 임상검사에서 93.18% (41/44)의 민감도와 100% (45/45)의 특이도를 보였다. 결론적으로 현장에서 RDT를 대체할 수 있는 민감도 높은 RT-RPA LFD kit를 성공적으로 완성하였다.

(출처 : 요약문 5p)

Abstract ▼

Since the beginning of 2020, we have tried to develop a high-sensitivity and rapid on-site diagnosis system for the SARS-CoV2 virus that is prevalent in Korea and around the world. We developed diagnostic kits, Rapid Diagnostic Test (RDT), which enables on-site diagnosis using antigen and antibody i

Since the beginning of 2020, we have tried to develop a high-sensitivity and rapid on-site diagnosis system for the SARS-CoV2 virus that is prevalent in Korea and around the world. We developed diagnostic kits, Rapid Diagnostic Test (RDT), which enables on-site diagnosis using antigen and antibody immune reactions, and Recombinant Polymerase Amplification (RPA), an isothermal nucleic acid amplification method with very fast nucleic acid amplification reaction, enables rapid and simple diagnosis at the test site. Unlike the RT-PCR method, the RPA method has the advantage of being able to react with nucleic acids prepared by an ultra-simple nucleic acid extraction method in a field different from the laboratory because the purity of the nucleic acid is not important. Even if the sample pretreatment process was reduced to 1/10 from 30 minutes to 3 minutes with the Arcis Sample prep kit selected in this study, not only the RPA reaction, but also RT-LAMP and real time RT-RPA were well-reacted. This reaction, the nucleic acid amplification reaction, was carried out at 37°C for 20 minutes using an nfo kit developed by TwistDx. After the reaction, the result can be analyzed within 2 minutes on the lateral flow detector. It was confirmed that it is a method that can replace RDT with low sensitivity since it takes a total of 25 minutes from sample processing to result analysis in the field. In order to select the gene target that responds best to the RPA reaction, primers/probe sets for the Orf1a, E gene, and RdRp genes were designed and compared and evaluated. As a result, Orf1a showed the best response. It was 100% consistent with the primers/probe sets used in real time RT-RPA kit and RT-RPA LFD kit. The analytical limit of real time RT-RPA was 0.1 pg, and the analytical sensitivity was up to 1x10²/ul. The RT-RPA LFD kit had an analytical limit of 0.1 fg and an analytical sensitivity of up to 1x10²/ul, and the reaction occurred well without interference with rivavidin, immunogloblin, dexamethason, mucin, and bovine serum albumin. In addition, it did not respond to Adenovirus, Human Rhinovirus, Human Bocavirus, and Human Enterovirus. The analysis of analytical specificity (cross), precision (repeatability), precision (reproducibility), accuracy, cross-contamination, etc. for obtaining approval from the Ministry of Food and Drug Safety all achieved good results. In a clinical examination conducted at Chonbuk National University with IRB approval, a sensitivity of 93.18% (41/44) and a specificity of 100% (45/45) were shown. In conclusion, we successfully completed the highly sensitive RT-RPA LFD kit that can replace RDT in the field.

(source : Summary 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 7
• 제1장 최종 목표 ... 7
• 제2장 국내외 기술현황 ... 15
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 22
• 제4장 최종 연구 결과 ... 27
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 81
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 82
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 84
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 84
• 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 84
• 제10장 참고문헌 ... 86
• 제11장 첨부서류 ... 87
• III. 제1세부 용역연구용역과제 연구결과 ... 88
• 제1장 제1세부연구용역과제의 최종 연구목표 ... 88
• 제2장 제1세부연구용역과제의 국내외 기술 현황 ... 88
• 제3장 제1세부연구용역과제의 용역과제 내용 및 방법 ... 91
• 제4장 제1세부연구용역과제의 최종 용역과제 결과 ... 92
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 129
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 130
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 132
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 132
• 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 133
• 제10장 참고문헌 ... 134
• 제11장 첨부서류 ... 135
• IV. 제2세부용역과제 연구결과 ... 136
• 제1장 제2세부연구용역과제의 최종 연구목표 ... 136
• 제2장 제2세부연구용역과제의 국내외 환자 발생 현황 ... 136
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 140
• 제4장 최종 연구 결과 ... 140
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 158
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 158
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 161
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 161
• 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 161
• 제10장 참고문헌 ... 162
• 제11장 첨부서류 ... 163
• 끝페이지 ... 165