[보고서]인간 NSD1 호모로그 유전자 변이 초파리를 이용한 Sotos Syndrome 발병기전 연구

이임순

[국가R&D연구보고서] 인간 NSD1 호모로그 유전자 변이 초파리를 이용한 Sotos Syndrome 발병기전 연구
Analysis of novel signaling pathways associated with human Sotos Syndrome caused by aberrant expression of NSD1 using a drosophila model system 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	건국대학교 KonKuk University
연구책임자	이임순
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2023-06
과제시작연도	2022
주관부처	교육부 Ministry of Education
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202300005652
과제고유번호	1345351831
사업명	개인기초연구(교육부)
DB 구축일자	2023-09-07
키워드	후성유전학.소토스병.히스톤메칠화.NSD.H3K36.epigenetics.Sotos syndrome.histone methylation.

초록 ▼

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
본 연구에서는 인간 NSD1의 초파리 호모로그인 drosophila NSD를 이용하여 결핍 형질전환 초파리를 구축하고 Sotos syndrome의 발생에 있어서 히스톤 H3K36 메칠화의 역할 및 기능, 그리고 관련 신호전달 경로 등을 in vivo에서 규명하고자 함. 또한 후성유전학적 조절의 통제가 가능한 치료제 개발을 위하여 전사활성과 억제의 양면성을 가진 초파리 NSD 및 인간 NSD1의 in vitro 분석연구도 진행하고자 함.
전체 내용
I. 정상 초파리 개체에서의 NSD의 발현 양상과 기능을 분석하여 인간 NSD1의 호모로그임을 확인하였음.
- 개체내 발현 패턴 및 세포내 위치 분석
- NSD 및 NSD1 단백질 기능 분석
II. NSD loss-of-function 형진전환 개체와 NSD 과발현 초파리 모델을 제작하여 발달 장애 및 호르몬 리간드 관련 신호전달 경로내 NSD의 역할, 그리고 Sotos 증후군과의 관계를 분석하였음.
- K/O 초파리 제조
- K/O transcriptome 분석 및 관련 경로 확인
- 신호경로 관련 유전자들의 확인
- NSD1 발현 add-back 초파리 제조 및 회복 확인

연구개발성과
▶ NSD1의 이상발현에 의하여 유발되는 Sotos 증후군의 원인규명과 새로운 연관 신호경로의 발굴에 기여함.
▶ NSD에 의한 H3K36 메칠화의 히스톤 코드 해석에 기여함.
▶ 성과 정보: SCI 논문 게재 6편, 국제 학술 대회 초청강연 1건, 학술 대회 논문 발표 13건, 수상 실적 3건, 학위 배출 인력 박사1건 석사 4건.

연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
▶ NSD 유전자군들에 속하는 유전자들의 이상발현에 의한 인간유전질환이나 암의 발생 등과 관련된 신호전달 및 발생 기전 연구에 활용.
▶ H3K36 메칠화와 관련된 다양한 암 관련 진단 시약과 치료제를 개발하는데 직접 활용.
▶ 후성 유전의 중심인 히스톤 코드 해독 분야에서 선도적 역할을 할 수 있는 연구력 향상 및 연구 인력 양성 효과가 있음.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
요 약 문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 6
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 22
1) 연구수행 결과 ... 22
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 25
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 25
6. 참고문헌 ... 27
끝페이지 ... 27

표/그림 (38)

표 Overexpression of the drosphila NSD fragment with pET38a_NSD_F3 clone and its purification by Ni-NTA affinity column purification. (A) Optimization of the induction condition of pET28a_NSD_F3 vector. Chapheron DNAs were added when transformed with the vector DNA. Bacterial cells were treated with 10ul/ml arabinose during the incubation period and subcultured up to the O.D 0.4. (B) Successful purification of the drosophila NSD fragment. (upper panel; SDS gel analysis of the eluent of each sample from the NSD protein purification step using His-tag affinity column. lower panel; Western blotting analysis using 6x His-tag antibody (ab137839, Abcam)
표 NSD SET domain deletion mutant 초파리 strategy
표 NSD SET domain deletion mutant Drosophila identification. (a) To confirm the deletion of the NSD SET domain region, primers (F1, R1) were constructed at the exon 1 and DsRed sites and PCR was performed to confirm the defect at the front region. The primers F2, (B) Confirmation of NSD RNA expression pattern by qRT-PCR (c) Confirmation of NSD protein expression pattern by western blot
표 NSD knock-out Drosophila strategy
표 Identification of NSD knock-out flies. NSD knock-out sequencing revealed that A was missing in the exon 1 of the NSD knock-out Drosophila, due to the frameshift, resulting in stop codon
표 luciferase assay of the NSD promoter region: When the NSD promoter region was deleted from 5 'to the transcription start site (+1), the activity change of the promoter was observed. Promoters, including 1.5 kb and 1.0 kb, showed normal expression, but transcriptional levels decreased when deletion occurred up to -594 bp. These results indicate that the site is critical for the activity of the promoter
표 Protein domains of human NSD1 and drosophila NSD
표 NSD protein purification results
표 NSD SET domain deletion mutant 초파리의 salivary gland에서의 단백질 발현
표 NSD SET domain deletion mutant 초파리 확인
표 pricking infection 한 초파리의 survival rate
표 각 mutant 초파리와 wild-type 초파리의 drosomycin mRNA 발현 정도 비교
표 NSD1 돌연변이 세포주의 확인 (A) NSD1의 유전자구조의 이미지. 5번 엑손에 CRISPR/Cas9의 표적 부위가 위치. (B) 야생형의 NSD1 유전자와 비교하을 때 각 돌연변이 세포주에서 생성된 틀이동 돌연변이를 나타냄. (C) 돌연변이 세포주에서 H3K36의 메틸화가 감소한 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인
표 NSD1 돌연변이 세포주의 형태 비교
표 크리스탈바이올렛 염색법으로 측정한 NSD1 돌연변이 세포주의 성장 감소. (ANOVA, LSD, **:p<0.005, ***: p<0.001)
표 NSD1 돌연변이 세포주에서 pERK의변화
표 NF-κB 결합부위를 가지는 프로모터를 포함하고 루시퍼레이즈를 발현하는 벡터를 이용한 NF-κB 활성 측정 (ANOVA, LSD, ***: p<0.001)
표 pUAST_NSD1 cloning result
표 과발현 세포주의 genomic DNA를 이용한 PCR 실험과 제한효소 실험
표 NSD SET 돌 연변이 초파리의 히스톤 변형 패턴을 웨스턴 분석법으로 조사
표 The summary of differentially expressed genes in the NSD SET domain deleted fly
표 NSD 과발현 초파리 모델과 대조군에서의 AMP 발현의 변화
표 NSD 과발현 초파리와 대조군 초파리의 감염 실험 이후 각 박테리아에 의한 AMP 발현 변화
표 혈청 처리에 따른 NSD1 돌연변이 세포주의 ERK 인산화. 대조군과 NSD1 돌연변이 세포주 모두 ERK 인산화가 활발하게 일어나는 것을 확인함
표 혈청 처리 후 시간 경과에 따른 ERK 인산화 변화. 대조군보다 NSD1 돌연변이 세포주의 ERK 인산화가 빠르게 감소하는 것을 보여준다
표 NSD 과발현 초파리 모델과 대조군에서의 AMP 발현의 변화
표 NF-kB 결합 부위를 포함하는 프로모터에 대한 NSD 과발현의 효과. (A) 초파리 S2 세포 형질감염에 사용된 벡터 구성. (B) 형질감염된 세포의 루시페라제 분석 결과
표 attacin-promoter driven luciferase plasemid 제조와 NSD 발현 plasmid와의 동시행산감염 실허
표 초파리 ovary의 NSD 발현 패턴
표 NSD-/- 파리에서 비정상적인 follicle cell의 발생. (A) follicle cell의 불규칙한 모양 (흰색 화살표). (B) follicle cell이 없는 egg. (C) follicle cell 발달과 관련된 유전자들 의 상대적 mRNA 발현 수준(NSD-/- 난소 vs. wt). 데이터는 평균 ± SE로 표시(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
표 pUAST-NSD 클로닝. pUAST_NSD1 recombinant plasmid map (왼쪽) 과 BamH Ⅰ enzyme cutting(오른쪽)을 통한 클로닝의 확인
표 Transient transfection of NSD with the AttA promoter containing deletions in NF-κB bindingsitesintoDrosophila Schneider 2 (S2) cells. (A) Western blot analysis to confirm the induction of NSD expression. To induce its expression from the MT promoter-driven vector, copper sulfate was treated. (B) The AttA promoter-driven reporter constructs used for the experiment. The NF-κB motifs at positions −46 and −118 in the AttA promoter are denoted as κB1 and κB2, respectively. (C) Transcriptional activation of the AttA promoter by NSD. (D) Downregulation of NSD-mediated transactivation of the AttA promoter upon the deletion of κB1 that responds to the Imd pathway. All data were normalized with the internal control, pAc5C-RL. Statistical analysis was analyzed using Mann–Whitney U test with SPSS (N.S. denotes no-significance, **P<0.05, ***P<0.005)
표 Effect of NSD expression on Relish activation in the Drosophila fat body. The cell extracts were prepared from the wandering 3rd instar larval fatbody (Cg fly lines) and from the larval whole body (Da fly lines) to perform western blot analysis with antibodies against the NSD protein, the inactive full-length form of Relish, and actin, respectively
표 Increased survival rates of NSD-overexpressing Drosophila 3rd instar larvae following Pe ingestion. Control and NSD-overexpressing larvae were naturally infected with Pe. Pe infections killed 70% of wild-type larvae within 48 h. NSD larvae died slower after Pe ingestion (90% lethality at 48 h) compared with the control larvae. The NSD-overexpressing flies were less susceptible to Pe infection than the control. (C) Relative survival rates of unchallenged NSD-overexpressing flies compared with control flies. Control flies survived longer than NSD-overexpressing flies. The flies were incubated at 29 °C with 60% humidity and normal light-dark cycles
표 Transcriptome analysis of the NSD null mutant fly. (A) In the transcriptome analysis result, the numbers of upregulation and downregulation genes are indicated. The number of genes that showed more than twice the change was counted. (B) The number of the upregulated genes encoded in chromosome 4 was increased 4-fold while that of the rest chromosomes was decreased 2~3-fold. It is a graph showing the percentage in (A)
표 Chromosome 4 variegation in NSD mutant model heterozygotes and homozygotes. (A) Eyes pictures show expression of variegating white transgenes on Chromosome 4 (E-G) and other chromosomes (A-D), in NSD heterozygous (-/+) and homozygous (-/-) background. (B) Eye phenotype was obtained by measuring eye pigmentation. This level normalizes to 39C-X. X: X chromosome(39C-X), 2L(T): 2L chromosome telomere(39C-5), 2L(P): 2L chromosome pericentric(39C-4), 3R(P): 3R chromosome pericentric(118E-12), 4(P): 4 chromosome pericentric(118E-10), 4(M): 4 chromosome medial(39C-12), 4(T): 4 chromosome telomere(118E-15)
표 The effects of NSD on fertility (A) Comparison of egg laying of wild-type flies, NSD-deficient flies and mutant NSD-deficient flies expressing DIAP1. 40 female flies were crossed with 25 males for analysis of egg-laying in standard medium. In the mutant NSD-deficient flies expressing DIAP1, egg-laying was restored as in wild-type flies. (B) 40 eggs were incubated in the standard medium at 60% humidity and 25°C. Error bar indicates standard deviation. Student t-test and Mann-Whitney U test were used with SPSS (**p<0.05; ***p<0.005; N.S. is no- significant difference.)
표 Confocal images of Drosophila ovary. Apoptotic cells were detected with anti-Dcp-1 and live cells were detected with anti-Delta. (A) In wild-type flies, the Delta was observed in follicle cells. (B-B’) The Dcp-1 was observed in the follicle cells and nurse cells of the NSD-deficient flies. Also, the abnormal morphology of follicle cells is shown. (C) In Mes4-gal4; NSD -/-, UAS-DIAP1 flies, the Delta was observed in follicle cells, and the Dcp-1 wasn’t observed in follicle cells and nurse cells. Also, the normal morphology of follicle cells is shown

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