초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
모든 필수아미노산의 생산에는 직간접적으로 NADPH가 환원력으로 사용되는데, 일반적으로 세포내에는 NADPH 보조인자 보다 NADH 보조인자의 양이 풍부하다. 이러한 보조인자의 균형문제와 효소의 보조인자 선택성으로 인해 필수아미노산의 생산량은 제한된다. 본 연구에서는 효소구조 기반 단백질공학 기술을 이용하여, 보조인자 균형문제를 해결한 개량효소의 개발 및 필수아미노산의 생산성을 증가시킨 균주 개발을 목표로 한다.
본 연구는 해당과정의 NADH-dependent Glyceraldehyde-3-pho

□ 연구의 목적 및 내용
모든 필수아미노산의 생산에는 직간접적으로 NADPH가 환원력으로 사용되는데, 일반적으로 세포내에는 NADPH 보조인자 보다 NADH 보조인자의 양이 풍부하다. 이러한 보조인자의 균형문제와 효소의 보조인자 선택성으로 인해 필수아미노산의 생산량은 제한된다. 본 연구에서는 효소구조 기반 단백질공학 기술을 이용하여, 보조인자 균형문제를 해결한 개량효소의 개발 및 필수아미노산의 생산성을 증가시킨 균주 개발을 목표로 한다.
본 연구는 해당과정의 NADH-dependent Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 대신 NADPH-dependent GapN 단백질 도입을 목적으로 한다. 하지만 대표적인 아미노산 생산균주인 Corynebacterium glutamicum 은 GapN이 없기에 이와 구조적으로 가장 유사한 단백질을 타겟으로 하여 C.glutamicum 유래 인공적인 GapN 효소 개발을 목적으로 하며, 연구목표는 크게 두가지로 구분한다.
1) C.glutamicum 균주 유래의 알데하이드 탈수소효소(ALDH) 중 GapN과 구조적, 기능적으로 유사한 단백질을 선별하고, 단백질의 구조를 기반으로 한 bio-engineering을 통해 C.glutamicum 균주 유래 자체 GapN 효소 개발을 목표로 한다.
2) 개발된 GapN 효소를 C.glutamicum 균주에 도입하여 아미노산 생산성이 향상된 새로운 아미노산 생산균주 개발을 최종 목표로 한다.

□ 연구결과
-Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 균주 유래의 알데하이드 탈수소효소(ALDH)들 중 GapN과 구조적, 기능적으로 유사한 7종의 ALDH 효소 단백질 7종을 선별.
-선별된 7종의 ALDH 효소 단백질의 발현 시스템을 구축.
-Ni-NTA Affinity chromatography, Ion-exchange chromatography, Size-exclusion chromatography를 이용하여 6종의 고순도 ALDH 효소 단백질을 확보하고 이들의 결정을 확보.
-4종의 ALDH 효소 단백질의 입체구조 규명 및 보조인자 복합체 구조 규명.
-12종의 다양한 알데하이드계 화합물을 기질로 사용하여 6종의 ALDH 효소 단백질의 in vitro 효소 활성 측정.
-입체구조와 ALDH 효소 단백질의 보조인자 선택성 및 기질특이성 등의 생화학적 특성분석결과를 종합하여 6개의 ALDH 중 Cg GapN 효소로 개량 가능한 최적의 후보 Cg ALDH를 선정.
-선별된 template Cg ALDH를 기반으로 Rational engineering을 통해 xeno-substrate 사용에 영향을 미치는 잔기의 돌연변이 유도.
-돌연변이 라이브러리를 이용하여 Glyceraldehyde-3-P 기질에 대한 친화성 및 활성을 기존의 것에 대비해 더욱 높인 인공 Cg GapN 변이단백질을 개발.

□ 연구결과의 활용계획
효소기질의 특이성을 변화시키기 위한 연구는 지금까지 계속되고 있으나 성공한 사례가 매우 적은 고난이도의 기술로 본 연구는 다양한 분야에서 원천기술로써 응용이 가능할 것으로 예상된다. 또한 본 연구에서 개발한 Cg GapN 효소는 모든 아미노산산업의 생산량에 전반적으로 영향을 미칠 것으로 예상되며, CJ제일제당 또는 대상과 같은 기업과의 공동연구를 통해 실제 산업에 적용하여 필수아미노산의 생산성이 크게 향상된다면, 이는 세계적으로도 경쟁력 있는 생산 기술이 될 것이다.

(출처 : 연구결과 요약문 3p)

Abstract ▼

□ Purpose & Contents
In the production of all essential amino acids, NADPH is used as a reducing power directly or indirectly. Generally, the amount of NADH cofactor is more abundant than that of NADPH cofactor in the cell. The production of essential amino acids is limited due to these cofactor

□ Purpose & Contents
In the production of all essential amino acids, NADPH is used as a reducing power directly or indirectly. Generally, the amount of NADH cofactor is more abundant than that of NADPH cofactor in the cell. The production of essential amino acids is limited due to these cofactor balance problems and the cofactor selectivity of the enzyme. In this study, using structure-based protein engineering technology, we aim to develop an improved enzyme that solves the problem of cofactor balance and to develop a strain with increased productivity of essential amino acids.
The purpose of this study is to introduce NADPH-dependent GapN protein instead of NADH-dependent Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in glycolysis. However, since Corynebacterium glutamicum , a representative amino acid-producing strain, does not have GapN, it aims to develop an artificial GapN enzyme derived from C.glutamicum by targeting the most structurally similar protein.
1) Select a protein structurally and functionally similar to GapN among aldehyde dehydrogenase (ALDH) derived from C.glutamicum strain, and aim to develop its own GapN enzyme derived from C.glutamicum strain through bio-engineering based on the protein structure do it with
2) The final goal is to develop a new amino acid-producing strain with improved amino acid productivity by introducing the developed GapN into the C.glutamicum strain.

□ Results
-Selection of 7 ALDH proteins structurally and functionally similar to GapN among ALDHs derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain.
-Construction of the expression system of the selected seven types of ALDH protein.
-Secure 6 types of high-purity ALDH proteins and their crystals using Ni-NTA affinity chromatography, ion-exchange chromatography, and size-exclusion chromatography.
-Determination of the three-dimensional structure of four ALDH enzyme proteins and the structure of the cofactor complex.
-Measurement of in vitro enzymatic activity of 6 types of ALDH proteins using 12 types of various aldehyde-based compounds as substrates.
-CgALDH as an optimal candidate among six ALDHs was selected by synthesizing the three-dimensional structure and biochemical characterization results such as cofactor and substrate specificity of the ALDHs.
- Mutagenesis of residues affecting the use of xeno-substrate through rational engineering based on the selected template CgALDH.
- Development of artificial CgGapN mutant protein with higher affinity and activity for Glyceraldehyde-3-P substrate compared to conventional ones using mutant library.

□ Expected Contribution
Research to change the specificity of the enzyme substrate is ongoing, but it is a high-level technology with very few successful cases, and this study is expected to be applicable as a source technology in various fields. In addition, the CgGapN enzyme developed in this study is expected to affect overall production of all amino acid industries, and through joint research with companies such as CJ CheilJedang or Daesang, it is applied to the actual industry to significantly improve the productivity of essential amino acids. If so, it will be a globally competitive production technology.

(source : Summary 5p)

목차 Contents

• COVER ... 1
• 연구결과 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 5
• 1. 과제(학업․연구)의 개요 ... 7
• 1-1. Background ... 7
• 1-2. Research needs and objectives ... 7
• 2. 과제(학업․연구)수행 내용 및 결과 ... 10
• 2-1. Determination of CgGapN candidate protein from Corynebacterium glutamicum ... 10
• 2-2. Development of NADPH-dependent artificial CgGapN protein ... 13
• 3. 과제 수행(학업․연구) 결과의 활용계획 ... 15
• 3-1. Necessity for further research ... 15
• 3-2. Utilization plan of research results ... 15
• 4. 연구성과 ... 16
• 5. 기타사항 (중요 연구 변경사항 등) ... 19
• 참고문헌 ... 19
• [붙임] 대표연구성과 ... 20
• End of Page ... 21