[보고서]Rhodococcus 속 균주의 다양한 quorum quenching 활성 규명 및 이를 이용한 식물 무름병 억제 biocontrol agent 구축

이정기

[국가R&D연구보고서] Rhodococcus 속 균주의 다양한 quorum quenching 활성 규명 및 이를 이용한 식물 무름병 억제 biocontrol agent 구축
Identification of quorum quenching enzymes in Rhodococcus spp. and its application as a biocontrol agent for prevention of soft rot disease 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	배재대학교 PaiChai University
연구책임자	이정기
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2023-03
과제시작연도	2022
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202300011275
과제고유번호	1711157837
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2023-10-18
키워드	쿼럼 퀜칭.쿼럼 센싱.로도코커스.AHL-락토네이즈.무름병.quorum quenching.quorum sensing.Rhodococcus.AHL-lactonase.soft rot.

초록 ▼

□ 연구개요
농산물의 식물 무름병을 제어하기 위한 농약의 사용은 잔류 농약으로 인한 문제점이 유발됨. 따라서 본 연구에서는 병원성 세균의 발병과 관련이 있는 쿼럼 센싱(quorum sensing, QS) 시스템을 차단하는 쿼럼 퀜칭(quorum quenching, QQ) 전략을 시용하여 세균으로 인하여 발생하는 세균병으로 인한 식물 무름병을 억제하고자 함. 이를 위하여 QS의 신호분자인 N-acylhomoserine lactone (AHL)을 효소적으로 불활성화 시킬 수 있는 균주 중 Rhodococcus 속 균주를 이용하여 무름병을 제어할 수 있는 QQ 활성 기반의 생물학적 방제 균주(biocontrol agent) 구축을 목표로 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
1. 다양한 Rhodococcus 속 quorum quenching 균주의 특성화 완료
- 이미 확보한 Rhodococcus 속 세균균주를 대상으로 QQ 활성 및 균주 특성 분석
-본 연구팀이 규명한 Rhodococcus sp. BH4의 전장 유전체 염기서열 정보를 활용해 다양한 QQ 효소 (AHL-lactonase, AHL-acylase, AHL-oxidoreductase) 관련 유전자들의 탐색
2. Rhodococcus 속 유래 다양한 QQ 관련 유전자 분리 및 돌연변이주 구축을 통한 개별 QQ 효소의 세포내 기능 규명 완료
- 아직 규명되지 않은 다양한 종류의 AHL-lactonase QQ 효소들에 대한 유전자 분리, 단백질 고발현, 정제 효소의 특성화 및 특성 비교
- 다양한 QQ 유전자들의 세포내 발현 특성 분석
- 다양한 QQ 유전자들의 결손 돌연변이주 구축 및 이들의 QQ 활성 비교 분석
- 다양한 QQ 유전자 및 돌연변이주들의 특성화를 통해 핵심적 기능의 QQ 효소 및 유전자 규명
3. Rhodococcus 속 QQ 균주에 의한 무름병 억제 효과 분석
- 국내 무름병 작물에서 분리한 Pectobacterium carotovora 에서의 AHL 생산과 병독성 인자 pectate lyase 발현과의 관련성 분석
- 다양한 Rhodococcus 속 균주에 의한 생물막 형성 억제 효과 분석
- 다양한 Rhodococcus 속 세균의 AHL 분해력에 의한 병독성 억제능 분석
- 다양한 QQ 균주와 무름병 균주의 co-culture 방법에 의한 AHL의 분해 및 병독성 억제 효과 분석
- Biocontrol agent 로서 QQ 균주 적용을 위한 Rhodococcus 균주에 의한 무름병 억제 효과 분석

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
- 세균성 무름병을 제어하기 위해 동제나 validamycin-A, streptomycin, oxytetracycline과 같은 농업용 항생제를 사용하는데 낮은 방제효과 뿐만 아니라 특히 항생제의 남용은 항생제 내성 균주의 출현 및 잔류 항생제로 인하여 국민 건강에 문제가 되고 있음. 본 연구 결과를 통해 병독성 유전자의 발현만을 억제시킴으로서 기존 항생제 사용량도 저감시킬 수 있는 새로운 세균병 억제 전략이기에 파급효과가 기대됨.
- Rhodococus 속 QQ 균주를 이용한 무름병 제어 biocontrol agent 균주 구축 연구 결과는 비교적 실제 적용 연구가 가능한 장점이 있어 향후 언제든지 실제 적용 시험을 시도할 수 있음.
- 세균성 감염증에 의해 피해는 의학 뿐 만 아니라 농축산업과 양식 산업 등에 걸쳐 많은 분야에서 손실이 막대함. 따라서 이러한 세균 감염증에 대한 새로운 차원의 QQ 기술 개발은 다양한 분야에서 의학적/산업적 응용성 큰 핵심 기반기술로서 활용할 수 있음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
① 두 type의 AHL-lactonase 유전자 jydB와 qsdA의 Rhodococcus sp. BH4 결손돌연변이 연변이 균주 구축 및 QQ 활성 비교 분석 ... 5
② QQ유전자의 결손돌연변이주들에 대한 QS 표현형 억제능 분석 ... 5
③ 확보하고 있는 Rhodococcus 속 분리 균주들의 16S rDNA 염기서열 분석 ... 5
④ Rhodococcus ruber PI33로부터 유래한 QQ 유전자 탐색 ... 5
⑤ Rhodococcus ruber PI33의 재조합 AHL-lactonase (QqrA) 단백질의 고발현을 위한 재조합 플라스미드 구축 ... 5
⑥ Rhodococcus ruber PI33 유래 Phosphotriesterase 계열 AHL-lactonase QqrA 단백질의 in silico 구조 분석 및 AHL-lactonase 유전자 주변의 유전자 분석 ... 5
⑦ P. carotovorum과 Rhdococcus sp. BH4의 co-culture를 통한 quorum quenching 활성 조사 ... 6
⑧ 재조합 AHL-lactonase QqrA 단백질에 의한 식물 무름병 억제 분석 ... 6
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 6
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 6
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 12
3) 목표 달성 수준 ... 12
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 13
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 14
6. 자체점검표 ... 15
7. 참고문헌 ... 15
붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 18
끝페이지 ... 18

표/그림 (13)

표 Comparison of QQ activity against different AHL substrates. QQ activity of Rhodococcus sp. BH4 and the knockout mutants using CV026 and NT1 biosensor strains
표 QQ activity against Pectobacterium carotovora. QQ activity of Rhodococcus sp. BH4 and the knockout mutants using NT1 biosensor strains
표 Comparison of biofilm formation inhibition by Rhodococcus sp. BH4 wild type and the AHL-lactonase deletion mutants. Inhibition of biofilm produced by Pseudomonas aeruginosa PAO1. Samples containing only P. aeruginosa PAO1 were used as control. Line graph shows the AHL concentration within the sample, either produced by P. aeruginosa PAO1 (control), or residual AHL concentration post-incubation with BH4 and mutants
표 Violacein inhibition by Rhodococcus sp. BH4 and AHL-lactonase mutants. Incubation of Chromatobacterium violaceum with cell free extracts of wild type, ΔqsdA, ΔjydB and ΔqsdAΔjydB mutants to assess violacein production. (A) Reduced violacein production can be seen as the lightening of the purple color in comparison to the control. (B) Violacein and AHL concentration measured spectrophotometrically
표 Phylogenetic analysis of quorum quenching Rhodococcus sp. strains. Neighbor-joining tree is based on the 16S rDNA gene sequences of Rhodococcus sp. Rhodococcus sp. BH4 is indicated with an asterisk. The dendrogram was constructed using the neighbor-joining method MEGA X software (http://www.megasoftware.net/). Rhodococcus sp. BH4 is indicated with an asterisk. The scale bar represents 0.5 substitutions per nucleotide. ● : R. ruber PI33, ▲ : R. erythropolis
표 Purification of recombinant QqrA protein by a Ni-NTA column. (A) supernatant of E. coli cell extract as the transformant (B) purified recombinant QqrA protein. The recombinant QqrA protein is located at 35 kDa.
표 Active site view of R. ruber PI33 QqrA and R. erythropolis W2 QsdA. The structure of active sites of QqrA and QsdA are identical. (QqrA: orange color, QsdA: blue color)
표 The organization of genes adjacent to qqrA and qsdA. Genes upstream and downstream of (A) qqrA from R. ruber PI33 and (B) qsdA from R. erythropolis R138
표 HHL-degrading enzyme activity by a purified recombinant QqrA protein. HHL was completely degraded by a recombinant QqrA protein. (① : 0.2ug, ② : 0.4ug, ③ : 0.6ug, ④ : 0.8ug, C : Control (HHL only))
표 AHL degrading activities of Rhodococcus sp. BH4 and its mutants toward AHL produced by P. carotovorum during co-culture. P. carotovorum pure culture as a control (A), AHL-degrading activities of Rhodococcus sp. BH4 toward AHL produced by P. carotovorum (B), BH4 (ΔqsdA) (C), BH4 (ΔjydB) (D) and BH4 (ΔjydBΔqsdA) (E) are shown
표 Galacturonase activities after coculturing Rhodococcus sp. strains and P. carotovorum. galacturonase activities were measured using P. carotovorum as a control, and co-culture of P. carotovorum and Rhodococcus sp. BH4 (wild type, ΔjydB, ΔqsdA, ΔjydBΔqsdA)
표 Pectin lyase activities after coculturing Rhodococcus sp. strains and P. carotovorum. Pectin lyase activities were measured using P. carotovorum as a control, and co-culture of P. carotovorum and Rhodococcus sp. BH4 (wild type, ΔjydB, ΔqsdA, ΔjydBΔqsdA)
표 Potato and cabbage slices infected with Pcc only A) and Pcc infected with the addition of recombinant QqrA protein B) Soft rot was inhibited on the slices treated with recombinant QqrA

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