초록 ▼

연구개요
CRISPR 기반 유전자 편집기술을 활용하여 food allergy 환자의 최대 20%에서 발생하는 토마토 알러지 유발물질(Profilin 등) 생성 유전자의 염기교정 연구를 확립하고 향후 타 식물에서 비호감 물질의 생성을 제어하는데 적용 가능한 완성된 기술모델을 제시하였으며, CRISPR 기반 토마토 allergy 유발 타겟 유전자 Lyc e를 정밀하게 교정하여 알레르기 유발물질(Profilin 등)의 합성을 억제하여 allergen-free 토마토 재분화체를 유도하여 비호감 물질 제어시스템을 개발하였음.
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연구개요
CRISPR 기반 유전자 편집기술을 활용하여 food allergy 환자의 최대 20%에서 발생하는 토마토 알러지 유발물질(Profilin 등) 생성 유전자의 염기교정 연구를 확립하고 향후 타 식물에서 비호감 물질의 생성을 제어하는데 적용 가능한 완성된 기술모델을 제시하였으며, CRISPR 기반 토마토 allergy 유발 타겟 유전자 Lyc e를 정밀하게 교정하여 알레르기 유발물질(Profilin 등)의 합성을 억제하여 allergen-free 토마토 재분화체를 유도하여 비호감 물질 제어시스템을 개발하였음.

연구 목표대비 연구결과
• 토마토 알레르기 유발물질인 profilin 합성유전자 구조 및 allele 분석을 실시함.
• Profilin 합성유전자로 Lyc e 주요 타깃 유전자로 선정, Lyc e 유전자 교정을 위한 lgE 결합부위 대상 gRNA 디자인 및 생물정보 기반 off-target 확인을 디자인함.
• 토마토에서 원형질체 기반 정밀교정 Ribonucleotide protein (gRNA+Cas9 complex)의 직접도입 방법에 의한 유전자 교정방법을 수행한 결과, 90% 이상의 세포 활성을 유지하는 토마토 원형질체 분리 조건 및 60% 이상의 효율을 가지는 원형질체로의 RNP 전달 조건을 확립함.
• 확립된 RNP 전달 유전자 교정방법을 이용하여, 토마토의 Lyc e1 유전자 교정을 위해 gRNA의 효율을 분석한 결과, 59% 변이가 유도되는 gRNA을 확보
• 아그로박테리움 플라스미드 이용 Lyc e 유전자 교정을 수행하여, 재분화체 중 88%에서 Cas9 삽입을 확인했고(재분화체 유도율 52%), 아그로박테리움 매개 CRISPR Cas시스템의 도입부터 토마토 재분화 교정체 확보까지 기술을 확립함.
• 아그로박테리움 매개 형질전환 결과, Cas9 삽입이 확인된 13개의 T₀ 재분화체 식물에서 100% 변이가 발생하였고, 개체에 따라 변이율은 47~96%로 발생함. 그 중 3개체(12%)에서 Biallelec mutation이 발생하여 후대검정을 실시함.
• T1 세대에서 Lyc e 유전자 변이가 확인된 Cas9-free 동형접합체를 선별하여, 교정체로부터 profilin 생성 유전자 발현특성을 조사하였고, 과실로부터 단백질 추출을 통해 allergen합성 억제를 확인함.
• 토마토 과실에서 Lyc e 유전자 비활성화 및 allergy 유발 profilin 생성억제로 인한 allergty-free 토마토 생산 가능성을 dot-blotting을 통해 최종 검증함.

연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
• 토마토는 세계 2000조원 이상의 고부가 경제작물이고, 국내는 200억원 이상의 종자시장을 형성하고 있으나, 2/3 이상이 일본과 유럽종자로 채소 전체 로열티 금액 7,900억원의 상당부분을 차지하고 있어, 조기 품종개발 기술이 요구되고 있고, 본 기술로 세계 유일의 allergy-free 토마토 품종개발 출시가 가능해짐.
• CRISPR 유전자가위 기술의 글로벌 시장 규모는 연평균 36.2%(2016-2022년)로 성장하고 있고, 식물에서도 향후 3년(~2020년) 안에 3억 달러 이상(최근 성장률 대비 4배 이상 증가) 성장이 예상되고 있어, 토마토 신품종 육성을 위한 유전자 편집기술의 확립으로 글로벌 종자시장에 후발주자이지만 틈색 전략용 기술이 확립됨.
• 확립된 기술은 다른 작물의 비호감 물질 제어, 식의약 소재의 독성물질 제어 등 작물의 형질교정에 확대 적용이 가능해짐.
• 일본의 GABA 토마토, 영국의 크리스퍼 기술적용 농산물 품종 승인에 이어 국내 유전자가위기술을 통한 품종 상용화는 품종 개발 비용을 약 3~5억 원 정도로 추정할 경우 200배 이상 비용을 절감할 수 있어 종자기업의 시장 진입이 촉진됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
• (1) 토마토 profilin 합성 유전자 구조 및 allele 분석 ... 4
• (2) Lyc e 유전자 교정 gRNA 디자인 및 off-target 분석을 분석툴 적용 ... 4
• (3) 형질교정체 유도 CRISPR RNP 전달기술 비교 검증 ... 5
• (4) 토마토 Lyc e 유전자 녹아웃 도입 및 원형질체 세포배양 ... 8
• (5) pKI1.1R vector를 활용한 pKI1.1R::AtU6p::Lyc e1.01 & Lyce1.02 다중 sgRNA construct 제작 ... 8
• (6) Agrobacterium을 매개로 한 토마토 Lyc e1.01유전자 교정 ... 9
• (7) 토마토 Lyc e1 유전자 교정체(13 T0 & 2 T1)의 allergen 유발 profilin 단백질 생성 및 표현형 비교 ... 11
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 12
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 12
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 13
• 3) 목표 달성 수준 ... 13
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 14
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 14
• 6. 자체점검표 ... 14
• 7. 참고문헌 ... 15
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 18
• 끝페이지 ... 29