초록 ▼

□ 연구개요
본 연구개발은 세포표면 개질 기반 세포-세포간 유전자 전달체를 활용하여 환자유래 역분화줄기세포를 혈관화된 3차원 근육 오가노이드로의 운명조절기술 개발 및 근육질환동물과 약물 스크리닝 플랫폼의 안정성·유효성 평가를 최종 목표로 함. 노화성/퇴행성 근육소모성 질환과 같은 난치·불치 질환의 치료 및 신약 독성·효능 검사 플랫폼으로도 응용 가능한 이 기술의 세부목표는 (1) 양/음전하를 띄는 다공성 생체고분자층 기반 layer-by-layer 세포-세포간 junction 형성 기술 개발 (2) 이러한 생고분자층으로 나뉜

□ 연구개요
본 연구개발은 세포표면 개질 기반 세포-세포간 유전자 전달체를 활용하여 환자유래 역분화줄기세포를 혈관화된 3차원 근육 오가노이드로의 운명조절기술 개발 및 근육질환동물과 약물 스크리닝 플랫폼의 안정성·유효성 평가를 최종 목표로 함. 노화성/퇴행성 근육소모성 질환과 같은 난치·불치 질환의 치료 및 신약 독성·효능 검사 플랫폼으로도 응용 가능한 이 기술의 세부목표는 (1) 양/음전하를 띄는 다공성 생체고분자층 기반 layer-by-layer 세포-세포간 junction 형성 기술 개발 (2) 이러한 생고분자층으로 나뉜 세포-세포간 유전자 전달 기반 근육/혈관세포로의 운명조절기전 연구 (3) 세포- 세포간 junctions 별 유전자 전달의 기전에 관한 연구 (4) 혈관화된 고기능성 3차원 근육 오가노이드 복합 조직제작 기술 확보 (5)　생체 내 이식된 혈관화된 3차원 근육 오가노이드의 안정성/유효성 평가 및 고기능성 약물 스크리닝 플랫폼 개발임

□ 연구 목표대비 연구결과
● 1mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine, 환원제)를 사용하여, 근육전구세포(c2c12)의 세포 표면에 thiol 그룹 형성을 통해 TCEP 처리된 그룹의 세포접착력, 세포 크기, 세포 내부의 tension 그리고 cell traction force가 증가함을 증명함.
● 위의 연구 결과에 이어, 근육전구세포의 세포표면을 환원처리를 하였을 때에 세포 접착력과 cell-cell interaction의 증가를 통한 근육 분화능력이 증가함을 증명함.
● 또한 이러한 환원제를 사용하여, 세포 표면에 음전하를 띄게 하고, 영전하는 띄는 키토산을 기반으로 한 layer-by-layer 구조 형성방법 최적화함.
● 환자유래의 Thyroid 근육과 mouse의 Gastrocnemius 근육조직에서 근육줄기세포를 분리하였으며, 근육줄기세포의 증식과 분화능를 확인하였음.
● 세포표면의 특성을 조절하여 세포의 다층구조를 형성 시에, 세포 하층 (bottom
layers)의 MSC (GFP cell tracker) 세포와 상층 (upper layers)의 근육전구세포 혹은 환자유래 thyroid 근육유래 줄기세포 (RFP cell tracker)를 환원 처리 후에 layer-by-layer method로 3D 다층구조의 세포 적층을 성공적으로 형성함.
● layer-by-layer 형성 후의 상층 donor 세포 내의 형광물질이 하층 세포로의 이동이 관찰됨에 따라 세포-세포간 간극을 통해 키토산 다공성 고분자 막을 통하여 이동하였음을 증명함.
● layer-by-layer 시스템 과정을 이용하여 전달 해줄 공여세포로 GFP형광이 포함된 MyoD-overexpression gene을 형성하고 transfection하여 HEK 239T cells에서 GFP 형광이 receipient 세포에서 성공적으로 관찰함.
● 쥐의 경골(Tibialis Anterior) 근육에 BaCl₂처리를 통해서 근육 소모성 근육부상 질환 동물모델을 성공적으로 구축하였으며, 근육전구세포의 근육내 이식 (intramuscular injection) 후, TA 근육의 질량이 분화 된 근육세포가 이식된 조직에서 가장 크게 증가했으며, 사람 근육전구세포가 조직 내로 생존 및 생착하였음을 확인하여, 이식된 근육줄기세포의 조직재생 가능성을 제시함.
● 환자 유래 줄기세포인 iPSC (induced pluripotent stem cells)로부터 근육줄기세포로 분화할 수 있는 MSC (Mesenchymal Stem Cells)로 분화를 유도하였음.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
● 본 연구진이 제안하는 다공성의 생체고분자막을 이용한 물질전달 시스템 기반으로 타겟 유전자 (MyoD, Myf5, Pax7)등을 환자유래 역분화줄기세포에 전달하여, 본 연구에서 최적화하고자 하는 근육/혈관조직으로의 운명조절에 유용한 분화 프로토콜로서 활용할 예정임
● 이러한 다공성 생고분자층 및 donor세포시트는 가역적으로 손쉽게 제거할 수 있으므로, 다양한 계통의 표적세포로 줄기세포를 유도 분화시킬 수 있다는 응용성이 있음
● 근육조직의 실효적인 재생을 위한 환자유래 역분화 줄기세포 기반 치료원천 기술을 개발 시에 유용한 분화 프로토콜로서 활용할 예정임
● 또한, Wnt3a 단백질이 in vitro, in vivo 환경 내에서 근육세포 및 손상된 근육재생의 효능을 크게 향상시킬 수 있는 중요한 역할을 담당한다는 사실에 기인하여 약물 스크리닝 플랫폼에서 Wnt 신호전달체계로서 연구될 예정임
● 본 연구진이 제안하는 근육조직의 실효적인 재생을 위한 줄기세포 기반의 원천기술을 개발 및 안정성/유효성 검증 시에 유용한 근육질병모델로 활용할 예정임

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 5
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 6
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 6
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
• 3) 목표 달성 수준 ... 17
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 18
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 18
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 19
• 1) 과학적·기술적 활용계획 ... 19
• 2) 경제적·산업적 활용계획 ... 19
• 6. 자체점검표 ... 20
• 7. 참고문헌 ... 21
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 22
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 25
• 끝페이지 ... 28