보고서 정보
주관연구기관 |
국립축산과학원 National Institute of Animal Science |
연구책임자 |
오건봉
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2022-12 |
과제시작연도 |
2022 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO202300028197 |
과제고유번호 |
1395074314 |
사업명 |
바이오그린연계농생명혁신기술개발 |
DB 구축일자 |
2023-11-08
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키워드 |
돼지.각막.이종이식.거부반응.염증성 인자.pig.cornea.xenotransplantation.rejection.inflammatory factor.
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초록
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연구개발 목표 및 내용
최종 목표
DPF 수준의 이종이식용 형질전환 돼지 각막을 원숭이 이식에 활용하고 돼지 조직을 이식받은 영장류에서 발생하는 생화학적 변화 분석
전체 내용
○ 축산원에서 개발하고 보유중인 GTKO/MCP와 GTKO/MCP/TBM 돼지의 인공수정 또는 자연 교배를 통해 자손을 증식
○ 이종이식용 형질전환 돼지의 원숭이 이식에 활용
- (1차) GTKO/MCP/TBM 돼지의 전층 및 부분층 각막을 이종이식에 활용
- (2차) GTKO/MCP 돼지의 전층 및 부분층 각막을 이종이식
연구개발 목표 및 내용
최종 목표
DPF 수준의 이종이식용 형질전환 돼지 각막을 원숭이 이식에 활용하고 돼지 조직을 이식받은 영장류에서 발생하는 생화학적 변화 분석
전체 내용
○ 축산원에서 개발하고 보유중인 GTKO/MCP와 GTKO/MCP/TBM 돼지의 인공수정 또는 자연 교배를 통해 자손을 증식
○ 이종이식용 형질전환 돼지의 원숭이 이식에 활용
- (1차) GTKO/MCP/TBM 돼지의 전층 및 부분층 각막을 이종이식에 활용
- (2차) GTKO/MCP 돼지의 전층 및 부분층 각막을 이종이식에 활용
- (3차) GTKO/MCP/TBM 돼지의 전층 및 부분층 각막을 이종이식에 활용
- (4차) GTKO/MCP/TBM 돼지의 전층, 부분층 각막 및 신장을 이종이식에 활용
- (5차) DPF 시설에서 관리하는 GTKO/MCP 돼지의 전층, 부분층 각막 및 신장을 이종 이식에 활용
- (6차) GTKO/MCP/TBM 돼지의 신장을 이종이식에 활용
○ 이종이식에 의한 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이 여부 분석
- 부분층 각막 이종이식 수혜 원숭이 5두의 혈액 16개 샘플에서 분석 결과 모두 음성 확인
- 전층 각막 이종이식 수혜 원숭이 2두에서 분석 결과 모두 음성 확인
○ 돼지 신장을 이식받은 수혜 원숭이에서 PCMV 감염 분석 결과 음성 확인
○ 돼지 각막을 이식받은 수혜 원숭이에서 발생하는 생화학적 변화 분석
- 부분층 각막 이식 및 전층 각막이식 수혜 원숭이에서 항-공여돼지 PBMC IgG), IgM 항체,항-알파갈(wild type-PEC)IgG와 IgM, 항-비알파갈(GTKO-PEC)IgG와 IgM, 응고활성 표지자 D-dimer, 보체 활성 표지자C3a, 세포성 면역활성 표지자 IFN gamma,염증 표지자 MCP1을 이식편 소실 2개월 후까지 측정
- 그 결과 부분층 및 전층 이종이식에 관계없이 이식 편에 대한 IgG 또는 IgM 항체 반응이 유도되어 이식 후 30에서 40일경 최고치에 도달하였고, 시간이 지나면서 역가가 감소하였음. 첫 이식의 경우 부분층, 전층 이식 관계없이 항체 반응 유도와 각막 이식편 생존기간 간에 직접적인 연관성이 없었음. 하지만 재이식의 경우 급속한 항체 반응과 함께 이식편 소실이 관찰
- 염증반응, 응고 반응, 보체 활성, 세포성 면역 활성 표지자는 수술 직후 외에는 부분층, 전층 각막과 관계없이 이종 각막 이식에서 증가세를 보이지 않았음
○ 돼지 신장을 이식받은 수혜 원숭이에서 발생하는 생화학적 변화 분석
- 신장이식 후 항-공여 돼지 PBMC IgG, IgM 항체,항-알파갈(wild type-PEC) IgG와 IgM, 항-비알파갈(GTKO-PEC) IgG와 IgM, 응고 활성 표지자 D-dimer, cytokine인 IL-12P70, TNF, IL-10, IL-18, IL-6, IL-8, MCP-1, 보체 활성 표지자 C3a, IL-1A, IFN gamma, cell death (histone-DNAcomplex) 표지자를 거부반응으로 이식 편을 제거하거나 사망할 때까지 측정
- 그 결과 이종 신장이식의 경우 anti-CD154 면역억제제를 사용하여 항체 반응이 나타나지 않았음. 혈관내 응고 발생 지표인 D-dimer는 이식 후 계속 높은 수치를 보여 이식 거부반응이 혈관내 응고, 즉 혈전 현상 발생을 시사하였음. 이식 초기 수술로 인하여 염증성 cytokine이 증가하였다가 감소하고 다시 거부반응으로 실험이 종료될 시점에 다시 증가. 이는 이식 편이 괴사되면서 전신적인 염증반응을 유도한 것으로 판단됨. 이번 분석에서 hTBM 형질전환이 이식 성적에 뚜렷한 차이를 도출하지 않았음.
○ 혈소판 응집 분석기를 이용한 형질전환 돼지 세포의 혈소판 응집 정도 분석
- 사람의 혈소판 풍부 혈장에 여러 종류의 돼지 내피세포를 넣어주고 CaCl2나 ADP 첨가로 혈소판 응집을 유발하여 내피세포 종류에 따른 차이를 비교
- 사람의 혈소판 풍부 혈장과 media, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), wild type pig endothelial cells (WT-PEC), GTKO-PEC를 공배양하고 다양한 농도의 CaCl2를 첨가하여 응집을 유도 비교하였을 때 1) CaCl2 농도에 의존적으로 혈소판 응고가 촉진되었으며, 2) WT-PEC 공배양은 GTKO-PEC보다 혈소판 응집이 빨랐고, GTKO-PEC의 경우 HUVEC 공배양과 유사한 시점에서 혈소판 응집을 보임.
- 사람의 혈소판 풍부 혈장과 media, HUVEC, WT-PEC, GTKO-PEC를 공배양하고 다양한 농도의 ADP를 첨가하여 응집을 유도 비교하였을 때 1) ADP 농도에 의존적으로 혈소판 응고가 촉진되었으며, 2) 혈소판 응집 시작 시간은 내피세포 존재 유무, 종류에 따라 차이가 없었지만, 최대 응집능은 내피세포가 없는 media와 HUVEC이 존재하는 경우가 가장 높았고 GTKO-PEC > WT-PEC 순서로 최대응집도가 낮아졌음. 아마도 PEC와 사람 혈소판 간의 incompatible interaction이 있어 혈소판 응집반응이 다소 낮은 것으로 판단됨.
- 사람의 혈소판 풍부 혈장과 media, HUVEC, GTKO-PEC, TKO-PEC를 공배양 후 혈소판 응집을 비교하였을 때, 각 PEC 존재가 사람 혈소판 응집을 유도하지 않았으며, ADP 첨가로 응집 유도 시 각 세포 존재에 따른 혈소판 응집 정도에 차이 없었음. 하지만 CaCl2를 첨가하여 응고를 유도하면 GTKO-PEC에서 가장 빨리 응집이 일어났고 TKO-PEC에서 가장 느리게 일어났음. 이는 돼지 세포 자체가 사람 혈소판 응집을 촉진하기보다는 사람 혈장의 항체가 돼지 내피세포와 결합하면서 보체나 혈액응고 기전에서 활성이 일어나고 이차적으로 혈소판 응집을 유도하는 것으로 생각됨.
○ 돼지 혈관 내피세포와 영장류 대식세포와의 상호 작용 분석
- 돼지 혈관 내피세포와 영장류 대식세포를 공배양 후 cytokine IL-1, IL-6, TNF-α, IL-4, IL-10, chemokine MCP-1, RANTES 및 tissue factor, protease activated receptor 의 발현을 분석
- 공배양 후 시간 경과에 따른 염증성 cytokine TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현을 조사. 그 결과 공배양 12 ∼ 24시간에 cytokine의 발현이 현저히 증가. 또한, 영장류 및 돼지 chemokine의 발현도 24 ∼ 48시간에 현저히 증가. 영장류 tissue factor(TF)는 공배양 6 ∼ 12시간에 증가한 후 감소하나, 돼지 TF는 12 ∼ 36시간에 발현이 증가하여 유지. 이때 thrombin 억제제를 처리한 경우, 돼지 TF의 발현은 억제되나 영장류 TF의 발현은 오히려 증가함. 돼지 PAR1 발현은 공동배양 24시간에 현저히 증가하나 PAR2 발현 변화는 없음을 확인. 영장류 PAR1과 2의 발현은 모두 12시간에 현저히 증가하다가 감소
○ 인간 thrombin과 돼지 혈관 내피세포의 PAR-1 분자 간 상호작용 부적합성 규명
- 인간 thrombin을 돼지 혈관 내피세포에 처리하고 chemokine 발현을 정량 PCR로 조사하고 세포내 칼슘 이온의 유입을 유세포분석과 형광현미경으로 분석
- 인간 혈관 내피세포의 RANTES와 MCP-1 발현은 현저히 증가하였으나, 돼지 혈관 내피세포의 발현은 변화가 없음. 인간 thrombin의 자극에 의해 인간 혈관 내피세포 내로 칼슘이온의 유입은 현저히 증가하였지만, 돼지 혈관 내피세포로 칼슘 이온 유입은 미미. 인간 thrombin을 인간 혈관 내피세포에 처리하면 염증성 cytokine과 chemokine의 발현이 현저히 증가. PAR-1 억제제를 처리하면 cytokine, chemokine 발현이 억제. 인간 thrombin을 인간 혈관 내피세포에 처리하고 PAR-1 활성을 조사한 결과 PAR-1 활성이 증가 하였고, 억제제 처리로 활성이 감소. 인간 thrombin을 인간혈관 내피세포와 돼지 혈관 내피세포에 처리하면 NF-κB 활성이 인간 혈관 내피세포에서는 증가하였으나 돼지 혈관 내피세포에서는 변화 없음.
연구개발성과
* 요약기술
* ’붙임1 주요연구 성과요약‘으로 대체(상세)
연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
- 바이오 인공 장기관련 세계 시장은 점점 급성장하고 있는 추세에 이종이식용 형질전환 돼지 생산 분야가 인공장기 시장에 진입하여 의료용 축산업이라는 새로운 산업형성이 가속화에 기여
- 환자에게 감염 위험 없앤 돼지 사육 시설(DPF) 운용 체계 확립을 통해 이종이식을 위한 돼지 각막 안정적 공급 기반 구축
(출처 : 요약문 2p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 요 약 문 ... 2
- 목차 ... 5
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
- 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 7
- 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 8
- 1) 연구 수행 결과 ... 8
- 2) 목표 달성 수준 ... 51
- 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 52
- 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 52
- 2) 자체 보완활동 ... 52
- 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 52
- 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 52
- 끝페이지 ... 53
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