초록 ▼

□ 연구 목표 및 내용
◼ 최종 목표
콜라겐 타입 I (COLⅠ)의 발현을 억제시키는 것을 목표하는 기능성 크리스퍼 Cas12a (CRISPR/Cas12a) 단백질 개발

◼ 전체 내용
콜라겐의 mRNA를 조절할 수 있는 크리스퍼 단백질의 개발
크리스퍼 Cas12a 단백질에 돌연변이를 생성하여 콜라겐1의 발현을 다각도로 억제할 수 있는 기능을 갖도록 개선
기능성 크리스퍼 Cas12a 단백질을 시험관과 세포내에서 작동 분석
간섬유화 세포모델과 동물모델에서 효능 검사
동물모델에서의 독성,

□ 연구 목표 및 내용
◼ 최종 목표
콜라겐 타입 I (COLⅠ)의 발현을 억제시키는 것을 목표하는 기능성 크리스퍼 Cas12a (CRISPR/Cas12a) 단백질 개발

◼ 전체 내용
콜라겐의 mRNA를 조절할 수 있는 크리스퍼 단백질의 개발
크리스퍼 Cas12a 단백질에 돌연변이를 생성하여 콜라겐1의 발현을 다각도로 억제할 수 있는 기능을 갖도록 개선
기능성 크리스퍼 Cas12a 단백질을 시험관과 세포내에서 작동 분석
간섬유화 세포모델과 동물모델에서 효능 검사
동물모델에서의 독성, 안정성 검사 및 실용화 가능성 검증
Cas12a 단백질의 진단 기능이 개선된 단백질 개발
신속진단 크리스퍼 Cas12a 단백질의 개발 및 효과 검증
의료용 동위원소를 결합한 추적가능한 크리스퍼 단백질 개발

◼ 1단계
❏ 연구 목표
새로운 CRISPR 단백질을 개발하여 후보군을 최대한 많이 확보하고 세포수준에서 그 효과를 검증함. CRISPR 단백질에 의료용 동위원소를 결합하여 생체 내 추적이 가능하게 하여 비임상 모델에서 영상화와 치료가 가능하게함
❏ 연구 내용
후보군을 선정하는 과정에서 돌연변이 삽입 기법을 이용하여 아미노산을 변경하여 CRISPR 의 기능변경을 시도하여 20가지 이상의 클로닝된 단백질들의 정제조건을 맞추어 다음 실험을 위한 단백질을 확보함
in vitro 실험들을 통해 기존의 CRISPR 단백질과 개선되거나 변형된 CRISPR 단백질의 절단 활성을 cis-cleavage assay, trans-cleavage assay, binding assay 등으로 기능을 확인함
신속진단 크리스퍼 단백질, 유전자발현억제 크리스퍼 단백질을 개발하고 시험관/세포 기능을 검증함
콜라겐을 억제하는 crRNA 서열을 디자인 하고 사람세포와 쥐세포에서 유전자 전사 억제 효과를 검증함
간경화 쥐 비임상 모델을 만들고 의료용 동위원소를 크리스퍼 단백질에 결합하여 생체내 거동을 확인함과 동시에 콜라겐 억제 효과를 확인함

◼ 2단계
❏ 연구 목표
전사활성 CRISPR 단백질을 개발하고 정제하여 세포수준과 비임상 모델에서의 효능을 검증함
❏ 연구 내용
기능개선된 크리스퍼 단백질의 콜라겐 억제 효과를 확인하기 위한 비임상 동물모델을 수립하고 체내 전달 시스템을 수립하는 내용을 3차년도에 수행하였으므로 5차년도의 안정성검사, 독성검사를 수행하고 콜라겐 억제를 검증할 다른 모델 탐색.
추가 수행 연구로써 프로모터에 결합 하지만 절단하지 않는 개발된 크리스퍼 단백질의 특징을 이용하여 크리스퍼 단백질에 전사활성인자를 결합, 콜라겐을 증진시킬 수 있는 전략을 모색.
콜라겐 프로모터 분석으로 얻어진 crRNA 의 서열을 바탕으로 콜라겐을 증진시킬 수 있는 crRNA 서열을 확보
위의 전략으로 전사억제기능을 가지는 크리스퍼 단백질과 전사활성기능을 가지는 크리스퍼 단백질의 최종 선정하고 다양한 타겟 조절의 가능성을 시험

□ 연구성과
3차년도에 걸친 연구 정성적 연구결과로써 기능성 크리스퍼 단백질 후보군 20종을 개발하였고 기능을 확인할 수 있는 실험 조건을 확립함. 크게 두가지 개발군인 신속진단 크리스퍼 단백질과 전사발현억제 크리스퍼 단백질을 확보하여 이와 관련된 특허 2건을 출원함.

□ 연구성과의 활용 계획 및 기대 효과
크리스퍼 단백질은 원하는 유전자를 편집하거나 유전자 발현을 조절하는 도구로써 여러 분야로의 확장성을 인정받아 현재 응용연구가 활발히 이루어지고 있음. 아직 콜라겐 발현 조절을 목표로 하는 CRISPR/Cas12a 단백질은 보고 된 바 없으며, 특히 콜라겐을 발현시키는 DNA 상의 프로모터 서열 분석을 중심으로 한 절단 없이 발현을 방해하는 전략으로 콜라겐을 억제하는 방법은 intrinsic genetic expression을 조절하고자 하는 새로운 방법으로 제안하는 바, 현재 크리스퍼 단백질을 이용하여 개발된 첫 치료제인 카스게비가 영국에서 세계 최초로 허가 받아 관심을 모으고 있으며 아직 국내에서 개발된 유전자 치료제는 없는 점을 고려하면 정확한 목표 장기로의 약물전달 전략이 뒷받침 되었을 때 콜라겐 뿐 아니라 다양한 질병의 원인이되는 단백질을 유전자 변형 없이 발현을 조절하는 하나의 새로운 치료제가 될 것이라고 예상함. 더하여 추가연구 내용에서 제안한 신속 진단이 가능한 크리스퍼 단백질 또한 감염증 등을 확인하는 Post-of-care testing을 좀 더 빠른 시간 안에 이루어질 수 있게 하는데 유용할 것이라고 기대함.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• ① 단백질의 개량 과정 및 결과물 ... 5
• ② 신속진단 크리스퍼 단백질 개발 ... 7
• ③ 콜라겐 억제 크리스퍼 단백질 ... 10
• ➃ 의료용 동위원소 결합 영상추적이 가능한 크리스퍼 단백질과 간경화 모델에서의 적용 ... 12
• 3. 연구과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 15
• 1) 연구수행 결과 ... 15
• 2) 목표 달성 수준 ... 16
• 3) 목표 미달 시 원인 분석 ... 17
• 4) 중요 연구변경 사항 ... 17
• 4. 연구성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 17
• 5. 연구성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
• 6. 다음 단계 연구계획 ... 18
• 1) 연구 목표 및 내용 ... 18
• 2) 연구 추진전략 ... 19
• 3) 연구 추진일정 및 기대성과 ... 19
• 4) 다음 단계 연구비 사용계획 ... 20
• 5) 연구 성과의 활용방안 및 기대효과 ... 20
• 끝페이지 ... 25