초록 ▼

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
동물들은 살아가면서 극심한 온도의 변화 (추위, 더위), 기생충의 감염 등 다양한 환경적인 스트레스에 노출이 되고, 병에 걸리게 됩니다. 하지만 동물도 아프게 되면, 이를 대처하려고 약을 찾아 먹는 자가치유현상 (Self-medication behavior)을 보인다는 것이 알려졌습니다. 하지만 이러한 자가치유현상에 대한 연구는 아직까지 많이 이루어지고 있지 않습니다. 따라서 이 과제의 목표는, 초파리를 이용해, 스트레스 상황에서 자가치유 현상에 대한 모델을 구축하고, 이와 관련된 메

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
동물들은 살아가면서 극심한 온도의 변화 (추위, 더위), 기생충의 감염 등 다양한 환경적인 스트레스에 노출이 되고, 병에 걸리게 됩니다. 하지만 동물도 아프게 되면, 이를 대처하려고 약을 찾아 먹는 자가치유현상 (Self-medication behavior)을 보인다는 것이 알려졌습니다. 하지만 이러한 자가치유현상에 대한 연구는 아직까지 많이 이루어지고 있지 않습니다. 따라서 이 과제의 목표는, 초파리를 이용해, 스트레스 상황에서 자가치유 현상에 대한 모델을 구축하고, 이와 관련된 메커니즘, 및 체내감지 경로를 밝히는 것입니다. 또한 분자 수준에서 비타민 C 감지세포 내의 molecular sensor를 규명하고, 쥐에서도 보존이 되어있는지 확인할 것입니다. 그리고 비타민 C 감지 세포를 통해 치료하는데 도움이 될 인간의 질환들도 탐색해볼 것입니다.

○ 전체 내용
동물들은 살아가면서, 다양한 스트레스 환경에 노출이 되는데, 이에 대응하기 위해 자가치유 현상 (Self-medication behavior)을 보이는 것으로 알려져 있습니다. 하지만 이러한 현상에 대해서 아직까지 많이 밝혀지지 않았으며, 본 과제를 통해 연구팀은 초파리를 모델동물로 사용하여 자기치유 현상 모델을 먼저 확립할 것입니다.
1단계 연구는 스트레스를 줄 때 비타민 C 선호 증가 현상에 관여하는 감지 세포 발견과 메커니즘 규명이 목표입니다. 일단 비타민 C 선호현상을 보이는 스트레스를 먼저 찾고, 그러한 스트레스 상황에서의 행동 실험 조건 (비타민 C 농도, 자극의 시간 등)을 좀 더 최적화 할 것입니다. 그리고 비타민 C의 여러형태인 환원형, 산화형, 그리고 거울상 이성질체인 L형, D형에 대해 각기 다르게 선호하는지도 볼 예정입니다. 또 스트레스를 줄때 비타민 C 이외에 다른 항산화제에 대해서도 선호 증가 현상이 있는지 볼 예정입니다.
이후에 자가치유현상의 원인을 설명하기 위해, 스트레스를 줄 때 초파리 내에서의 비타민 C의 함량이나 항산화제의 함량, 혹은 활성산소의 양이 변하는지 볼 예정입니다. 이때 비타민 C를 미리 먹였을 때 위의 인자들이 회복이 되면서, 비타민 C 선호현상도 완화가 되는지 볼 계획입니다. 이외에 비타민 C 선호 증가 현상이 맛이나 냄새와도 관련이 있는지도 확인할 것입니다. 추후에 스트레스가 주어졌을 때 비타민 C를 찾아 먹게 하는데 관련하는 세포를 GAL4 library 내에서 찾을 예정입니다.
2단계 연구는 1단계에서 찾은 hit들을 좀 더 추리고, 추려진 hit line이 표지하는 감지세포 후보가 비타민 C에 반응하는지 밝힐 것입니다. 또, 체내 비타민 C 감지 경로를 밝히고, 감지세포 내의 molecular sensor를 규명하고, 이것이 쥐에서도 보존이 되어있는지 확인할 것입니다. 또 비타민 C 감지세포를 이용해 치료하는데 도움이 될 인간의 질환들도 탐색해볼 것입니다.
일단 hit line이 표지하는 세포가 비타민 C나 항산화제에 반응하는지 CaLexA tool을 통해 확인을 해보고, 이후에 실시간으로 반응하는지 GCaMP tool을 통해 확인해볼 것입니다. 또 single cell (type) 수준에서 연구하기 위해 Split GAL4를 만들 계획입니다. 그리고 감지세포 경로를 장·뇌 축 안에서 확인해볼 계획입니다.
이후에 single cell RNA-seq을 통해 항산화제 감지 세포 내에서 molecular sensor를 밝히고, 관련된 molecular pathway를 밝힐 것입니다. 또한 molecular sensor가 쥐에서도 보존이 되어 있는지 여부를 확인하고, 이를 이용해 Cre line을 만들어 해당 표지 세포가 비타민 C에 반응하는지 cellular activity indicator 인 c-Fos marker를 staining으로 확인을 할 것입니다.
마지막으로 비타민 C 감지세포를 이용해 치료하는데 도움이 될 human disease를 탐색할 예정입니다. 이때 human disease 관련 돌연변이 초파리를 이용해 비타민 C 선호현상이 감소하는 것을 보고, 비타민 C에 의해 disease phenotype이 회복되는 disease를 선별할 것입니다. 그리고 선별된 disease의 phenotype이 비타민 C molecular sensor의 발현조절이나 비타민 C 감지세포 활성화에 의해 호전이 되는지도 밝힐 계획입니다.

○ 1단계
● 연구 목표
본 과제의 1단계 연구목표는 자가치유현상 모델 확립을 위해, 초파리가 비타민 C를 더 찾아가는 스트레스 환경을 찾고, 그러한 환경에서 비타민 C 이외에 다른 항산화제들에 대해서도 선호도가 증가하는지 밝힐 것입니다. 그리고 자가 치유 현상이 일어나는 원인을 밝히기 위해, 해당 스트레스 환경에서 일어나는 체내 변화에 대해 확인해 볼 것입니다. 또한 스크리닝을 통해, 자가 치유 현상과 관련된 감지 세포를 찾을 예정입니다.

● 연구 내용
초파리가 비타민 C를 찾아 먹게 하는 스트레스 환경을 찾기 위해, heat-shock, cold-shock 등의 자극을 줄 예정이며, 먹이선택실험 (two-choice assay)를 통해 비타민 C에 대한 선호도가 증가하는지 확인할 계획입니다. 그리고, 행동 실험 조건을 좀 더 최적화 하기위해, heat-shock의 시간, 비타민 C의 농도 등 달리해볼 예정이며, 해당 조건에서 다른 항산화제에 대해서도 선호도가 증가하는지 볼 예정입니다. 또한 비타민 C는 환원형과 산화형, 그리고 거울상 이성질체인 L형, D형이 존재하는데, 초파리가 이러한 여러 형태들에 어떻게 다르게 선호하는지 볼 예정입니다.
자가치유현상이 일어나는 원인을 밝히기 위해 heat-shock을 주면 초파리의 체내에 비타민 C의 함량이나 항산화제의 함량 등이 변하는지 LC-MS나 western blot을 통해 확인해 볼 예정이고, 또 활성산소의 양이 체내에서 변하는지도 볼 예정입니다. 그리고 비타민 C를 미리 먹여, 비타민 C의 함량이나 활성산소의 양을 감소시킬 때 비타민 C의 선호현상이 완화하는지도 볼 예정입니다. 이외에 스트레스 상황에서 비타민 C를 더 찾아가는 현상이 맛이나 냄새와 관련이 있는지 확인하기 위해 해당 돌연변이 라인들을 이용해 선호현상을 볼 예정입니다.
마지막으로, 스트레스 환경에서 비타민 C를 선호하게 만드는 관련 세포를 찾기 위해, 세포를 표지할 수 있는 GAL4 library를 구해, 이들을 불활성화시켜 비타민 C를 덜 선호하는 GAL4 line들을 찾을 것입니다. 이때 감지세포를 장에서 찾는다면, GAL4 library로써 한국 초파리연구자원은행 (KDRC)의 K-Gut GAL4 library를 이용할 계획입니다. 만약에 감지세포를 행동 조절에 관련있는 세포들 중에서 찾는다면, Neuropeptide GAL4 library를 이용할 것입니다. 이렇게 찾은 GAL4 line은 비타민 C를 선호하게 하는데 관련이 있을 세포를 표지할 것입니다.

○ 2단계
● 연구 목표
본 과제의 2단계 목표는 1단계에서 찾은 hit들을 좀 더 추리고, 추려진 hit line이 표지하는 감지세포 후보가 비타민 C이나, 다른 항산화제에 반응하는지 확인해볼 예정입니다. 그리고 해당 감지세포가 어떤 경로를 통해 자가치유현상을 유도하는지 장·뇌 축을 통해 밝힐 것입니다. 또한 분자 수준에서 어떻게 항산화제를 감지하는지 알아내기 위해, 항산화제 감지세포 내의 molecular sensor를 발견하고, 관련 molecular pathway를 규명할 것입니다. 또, 해당 molecular sensor가 쥐에서도 보존이 되어있는지 볼 것입니다. 이외에 항산화제 감지세포가 치료에 도움을 줄 수 있는 인간의 질환들도 찾아볼 것입니다.

● 연구 내용
먼저, 1단계에서 찾은 hit들을 좀 더 추리고, 추려진 hit line이 표지하는 감지세포 후보가 비타민 C에 반응하는지, 혹은 다른 항산화제에도 반응하는지, 그리고 스트레스에 반응하는지 Calcium monitoring device인 CaLexA, TRIC tool을 이용해 확인할 예정입니다. (참고로, 이 두 가지 tool은 여러 시간, 여러 날 동안의 세포에 축적된 반응을 보여줍니다.) 이때 감지세포는 여러 기관에서 발현할 수 있으므로, 뇌, 장, Ventral nerve cord (VNC) 등에서 비타민 C에 대한 반응성을 확인합니다.
만약에 해당 감지 세포가 장에 존재한다면, 어떻게 뇌로 연결이 되는지, 장·뇌축 내에서 감지경로를 규명할 것입니다. 가령 감지세포가 장에서 Neuropeptide를 발현하는 세포이면, 뇌에서 Neuropeptide 수용체를 탐색할 계획이고, 감지세포가 장에서 Neuron으로 존재하면, 뇌 쪽으로 연결되어있는지 볼 예정입니다.
위의 감지세포의 존재가 규명이 되면, 해당 감지세포가 비타민 C 및 항산화제에 실시간으로 반응하는지, Patch clamp나 GCaMP system을 통해 ex vivo로 확인을 할 예정입니다. 또한 위의 스크리닝에서 찾아낸 세포가 여러 곳을 표지하기에, Split GAL4를 만들어, Single cell (type) 수준에서의 비타민 C에 대한 반응 여부를 보거나, 비타민 C 선호 행동에 대한 영향을 보려고 합니다.
이후에, 분자 수준에서 어떻게 비타민 C를 감지하는지 알기 위해, 비타민 C를 주었을 때, 해당 감지세포에서 특이적으로 발현양상에 변화가 있는 유전자를 Single cell RNA-seq을 통해 찾을 것입니다. 그리고 해당 유전자가 비타민 C에 반응하는 molecular sensor인지 확인하기 위해, 이 유전자의 발현을 조절해 비타민 C 선호에 영향이 있는지도 볼 것입니다. 또 해당 molecular sensor와 genetic interaction이 있는 유전자들을 찾아 비타민 C 감지세포 내에 molecular pathway를 규명할 예정입니다.
비타민 C molecular sensor를 찾게 되면, 쥐에서도 보존이 되어있는지 볼 계획입니다. 일단 쥐에서 비타민 C molecular sensor에 해당하는 상동 유전자를 찾아, 비타민 C를 주었을 때 발현양상이 변하는지 볼 예정입니다. 그리고 해당 유전자 프로모터에 의해 발현되는 Cre line을 확립해, 그 표지 영역에서 비타민 C에 의해 반응하는지 cellular activity indicator인 c-Fos marker를 staining을 통해 확인할 예정입니다.
마지막으로 비타민 C 감지세포를 통해 치료하는데 도움이 될 인간의 질환을 찾아볼 계획입니다. 우선 human disease 관련 돌연변이 초파리들을 얻어 비타민 C 선호에 문제가 생긴 line들을 선별합니다. 그리고 해당 line들이 비타민 C를 먹었을 때 disease phenotype이 회복되는 것을 확인하여 비타민 C에 효과가 있는 인간의 질환 후보를 선별합니다. 이후에 위에서 발견한 비타민 C molecualr sensor의 발현을 조절하거나, 비타민 C 감지 세포를 활성화 시켰을때 disease phenotype이 회복되는지 볼 예정입니다.

□ 연구성과
1. 정성적 연구성과 (연구결과)

○ 여러 가지 스트레스 중에서 Heat-shock을 주면 비타민 C 및 다른 항산화제에 대해 선호도가 증가함을 밝혔습니다. 그리고 관련 행동실험의 조건을 좀 더 최적화했습니다.
○ Heat-stress 상황에서 비타민 C 선호 증가 현상에 교배 유무, strain에 관계가 없음을 보았습니다.
○ Heat-stress 상황에서 비타민 C에 대한 선호의 증가는 단순히 산성으로 설명을 할 수 없으면서, 동시에 비타민 C의 pH에 영향을 받는 것으로 생각을 할 수 있습니다.
○ 산화형 비타민 C (DHA)가 항산화능력이 환원형 비타민 C에 비해 약 11% 정도임을 확인했으며, Heat-shock을 주게 될 때 초파리가 산화형 비타민 C (DHA)에 대해서는 선호도는 증가하지 않았습니다.
○ 40mM 환원형 비타민 C과 산화형 비타민 C (DHA)를 먹이면 heat-shock을 주어도, 비타민 C에 대한 선호도가 증가하지 않고 완화되는 것을 보았습니다.
○ Heat-shock을 받게 되면, 초파리 hemolymph내에 비타민 C 함량이 감소하는 것을 확인하였습니다. 또한 환원형 비타민 C나 산화형 비타민 C (DHA)를 미리 먹이고 Heat-shock을 주면, 초파리 hemolymph내의 비타민 C 함량이 증가함을 보았습니다.
○ Heat-shock을 받으면 장에서 활성산소 함량이 증가하는 것을 보았습니다. 또, 환원형 비타민 C나 산화형 비타민 C (DHA)를 미리 먹이고 Heat-shock을 주게 되면 활성산소 함량이 감소함을 보았습니다.
○ 미각이나 후각수용체가 망가진 돌연변이 초파리의 경우 heat-shock을 받으면 비타민 C를 더 찾아가는 것을 확인했습니다.
○ 비타민 C 선호행동에 관여하는 감지세포를 찾기 위해 GAL4 screening을 하였고, 41개 후보군 중에서 13개 line을 1차 screening의 hit로 선정하였습니다.

2. 세부정략적 연구성과

○ 과학기술/학술적 연구성과 - 학술대회 논문 발표 (국내 1건, 국제 1건)
- 미국 초파리 학회 참가 및 포스터 발표 (2023): Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Neurobiology of Drosophila

- 한국 초파리 학회 참가 및 포스터 발표 (2023): 52회 한국 분자·세포생물학회 초파리분과 (Korean Society for Molecular and Cellular Biology) 하계 연구발표회 (약칭: 한초연)

3. 2단계 연구기간 정성적 성과 목표

- CaLexA, GCaMP을 통해 감지세포 후보가 비타민 C나 항산화제에 반응하는지 확인

- 비타민 C 선호현상과 관련된 감지경로를 장·뇌 축에서 확인

- 비타민 C 감지세포 split GAL4 line 구축

- Single cell RNA-seq을 통해 감지세포 molecular sensor 확인

- Genetic interaction study를 통해 비타민 C 감지세포 내 molecular pathway 규명

- 쥐에서 molecular sensor 보존 유무 확인 및 관련 Cre line을 구축해 비타민 C를 감지하는 세포 확인

- human disease 관련 돌연변이 초파리를 이용해 비타민 C 감지세포를 통해 치료하는데 도움이 될 인간의 질환 탐색

4. 2단계 연구기간 정량적 성과 목표
- 학술대회 논문 발표 (국내, 해외)
- 본 과제의 연구결과를 바탕으로 학술지 논문 투고 및 게재

□ 연구성과의 활용 계획 및 기대효과
학계에서는 현재 포도당, 아미노산 등 Macronutrient (다량 영양소)에 대한 내부감지 세포 관련 연구가 활발히 이루어지고 있습니다. 하지만 아직까지 micronutrient (미량 영양소)에 대한 내부감지 세포연구는 거의 진행이 되지 않았습니다. 이 연구를 통해 비타민 C, 항산화제에 대한 내부감지 세포를 발견하게 되면, 미량영양소를 내부적으로 감지하는 세포를 발견하려는 후속 연구들이 많이 생길 것입니다.
또, 자가 치유 동물 (self-medication animal)이란 말이 있습니다. 한 가지 예를 들면, 침팬지가 아프면 어떤 약초를 먹어서, 상태가 호전됐다는 사례가 있습니다. 이를 이용해 자가 치유 동물들이 먹는 식물들을 찾아서 약으로 개발하려는 시도들이 있습니다. 본 과제에서 연구하려는, heat-stress 상황에서 초파리가 비타민 C를 더 찾아가는 행동, 역시 하나의 자가 치유 행동으로 볼 수 있습니다. 따라서 이러한 초파리 자가 치유 모델을 이용하면, 스트레스 완화에 도움을 주는 신약을 발굴하는 데 도움을 줄 것입니다. 만약에 이러한 set up이 잘 갖춰지게 되면, 신약개발단계에서 비용을 절감할 수도 있을 것입니다.
뿐만 아니라, heat shock을 받을 때 항산화제를 찾아 먹는다는 것은, 그만큼 우리 몸에 항산화제가 필요하다는 것입니다. 하지만 항산화제가 어느 기관에서 주로 필요해서 어떻게 작동하는지는 모릅니다. 이러한 메커니즘을 알아내면, 체내에서 항산화제의 역할을 자세히 규명할 수 있고, 차후 항산화제 연구에 큰 도움을 줄 것입니다.
마지막으로, 전 세계에서 항산화제 감지 시스템의 연구는 미미합니다. 본 과제를 통해, 항산화제를 감지하는 시스템을 발견하고, 망가졌을 때 질환을 밝히게 되면, 해당 시스템 중요성을 확인할 수 있을 것입니다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 7
• 1. 연구과제의 개요 ... 8
• 2. 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 8
• 3. 연구과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 12
• 1) 연구수행 결과 ... 12
• 2) 목표 달성 수준 ... 14
• 3) 목표 미달 시 원인 분석 ... 16
• 4) 중요 연구변경 사항 ... 17
• 4. 연구성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 17
• 5. 연구성과의 관리 및 활용 계획 ... 17
• 6. 다음 단계 연구계획 ... 18
• 1) 연구 목표 및 내용 ... 18
• 2) 연구 추진전략 ... 20
• 3) 연구 추진일정 및 기대성과 ... 23
• 4) 다음 단계 연구비 사용계획 ... 23
• 5) 연구 성과의 활용방안 및 기대효과 ... 23
• 참고문헌 ... 24
• 끝페이지 ... 29