초록 ▼

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
전체 연구기간 연구과제의 목표를 500자 내다양한 히스톤 변형 중, H3K4에 발생하는 trimethylation(H3K4me3)은 전사활성 마커로 널리 사용되고 있지만, 전사를 촉진하는지 또는 전사의 결과물인지 그 구체적인 역할이 논란이 되고 있다. 따라서, 본 연구는 Paf1복합체(Paf1C)의 구성성분 중 Leo1이 결손된 Saccharomyces cerevisiae 균주를 이용하여, H3K4me3과 유전자 발현과의 hierarchy를 확인하고, 이때 Leo1의 역할을 규명하는

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
전체 연구기간 연구과제의 목표를 500자 내다양한 히스톤 변형 중, H3K4에 발생하는 trimethylation(H3K4me3)은 전사활성 마커로 널리 사용되고 있지만, 전사를 촉진하는지 또는 전사의 결과물인지 그 구체적인 역할이 논란이 되고 있다. 따라서, 본 연구는 Paf1복합체(Paf1C)의 구성성분 중 Leo1이 결손된 Saccharomyces cerevisiae 균주를 이용하여, H3K4me3과 유전자 발현과의 hierarchy를 확인하고, 이때 Leo1의 역할을 규명하는 것이, 첫번째 목표이다. 그리고, 병원성 진균인 Candida albicans의 병원성 유전자 발현에 대한 히스톤 변형 또는 크로마틴 조절자들에 관한 연구가 매우 부족하므로, Candida albicans에 대한 Paf1C 결손 균주를 제작하여, 병원성 유전자 발현에 대한 Paf1C와 H3K4me3의 역할을 규명하는 것이 두 번째 목표이다. 마지막으로, C. albicans와 대식세포와의 상호작용에 대한 Paf1C의 영향을 연구함으로써, 캔디다증 치료제 개발에 필요한 정보를 제공하는 것이 최종 목표이다. 외로 기재

○ 전체 내용
H3K4me3은 전사가 활발한 유전자의 프로모터 및 5‘지역에 높게 분포함으로써, 전사 활성의 마커로 사용되고 있다. 하지만, 많은 연구들이 수행되었음에도 불구하고, H3K4me3이 전사를 촉진하는 것인지, 전사의 결과물인지 아직 불분명하다. 본 연구의 1단계에서는 H3K4me3을 유지하고 있는 Paf1C의 Leo1 결손 균주를 사용하여, H3K4me3이 스테롤 흡수에 필요한 유전자군의 발현을 촉진하는 것을 확인하였다. 또한, 스테롤 항상성 조절자인 Upc2의 발현을 억제하는 Leo1의 세포 내 새로운 기능을 확인하였다.

S. cerevisiae는 H3K4me3과 관련된 요소들이 잘 보존돼있지만, 생리학적 특성 관찰에 한계가 있다. 병원성 진균인 C. albicans는 출아 효모 상태로 지내다가 특별한 환경을 만나게 되면 균사를 형성하고, 이를 포함한 다양한 형태학적 변화는 C. albicans의 병원성 결정 중요한 요소이다. 하지만, C. albicans의 병원성에 관련된 유전자 발현에 있어서 히스톤 변형 또는 크로마틴 조절자들에 관한 연구는 매우 부족한 형태이다. 따라서, 본 연구의 1단계에서 CRISPR-Cas9 system을 이용해 C. albicans Paf1C 결손 균주를 제작하여 연구를 수행하였고, Paf1C의 구성성분 중 CTR9은 병원성 발현에 필요한 methionine metabolism에 중요한 조절자임을 확인하였다. 또한, LEO1은 Candida 야생형의 병원성 경로 유지에 중요하고, 이때 yeast 조건때 분포된 H3K4me3 양이 hypha induction에 의해 촉진되는 병원성 유전자 발현에 충분한 조건임을 확인하였다.

C. albicans와 숙주 면역 간의 상호작용은 C. albicans의 감염경로를 결정하는 중요한 역할을 한다. C. albicans는 대식세포를 포함한 숙주 내 환경에 맞서 형태와 대사를 조절하고, 대식세포 역시 Candida의 증식을 조절하며, Candida를 제거하기 위해 노력한다. 이러한 상호작용은 C. albicans의 감염 경로에 많은 영향을 준다. 따라서, 본 연구의 2단계에서는 CTR9-결손 균주가 감염된 대식세포의 dual RNA-seq 수행하여, Candida와 대식세포의 전사체를 동시에 분석하여, C. albicans-숙주 상호작용 과정에서 Ctr9의 기능을 규명하고자 한다. 그리고, 2단계 결과와 1단계 결과를 종합하여, 캔디다증 치료 표적 유전자를 제시하는 것이 최종 목표이다.

○ 1단계
● 연구 목표
1단계 연구 목표는 S. cerevisiae를 이용해 H3K4me3과 전사 간의 hierarchy를 규명하는 것이고, C. albicans 병원성에 대한 Paf1C의 역할을 규명하는 것이다. Paf1C 구성성분 (Paf1, Ctr9, Cdc73, Rtf1, Leo1) 중, Leo1이 없는 균주에 있는 H3K4me3이 특정 유전자 발현 촉진에 필수 요소인지 확인하기 위해, leo1Δ에 H3K4 methylation 결핍 균주를 제작하여, H3K4me3이 전사의 선행 조건인지 규명하고, 나아가 Leo1의 역할을 규명하고자 한다. 추가적으로, CDC73 결손 균주에 적은 양으로 남아있는 H3K4me3이 유전자 발현에 미치는 역할과 이때 Cdc73의 역할을 규명하고자 한다. S. cerevisiae를 이용한 유전자 발현 연구의 단점을 보완하기 위해, 병원성 진균인 C. albicans에 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 Paf1C 결손 균주를 제작하고, Paf1C 결손에 따른 H3K4me3 변화와 유전자 발현, 그리고 병원성과의 상관관계를 분석하여, Paf1C와 H3K4me3이 C. albicans 병원성 유전자 발현 미치는 영향을 규명하고자 한다.

● 연구 내용
S. cerevisiae leo1Δ의 전사체 분석을 통해, WT보다 2배 이상 발현이 증가하는 유전자는 Transcription factor인 Upc2와 이에 조절받는 sterol metaboilsm 유전자였고, 핵 내 Upc2의 단백질 레벨 또한 leo1Δ에서 증가하였다. 특히 Upc2-regulated sterol uptake 유전자의 발현이 증가하면서, 5‘지역에 WT에는 없던 H3K4me3이 분포하고 있었고, 실제로 leo1Δ cell은 외부 cholesterol 흡수하였다. 나아가, set1Δleo1Δ에서 H3K4me3이 없이는 sterol uptake 유전자들의 증가하지 않고, 외부 cholesterol 흡수가 저해되는 것을 확인함으로써, Leo1이 없을 때, H3K4me3은 sterol uptake 유전자들의 전사 활성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 즉, H3K4me3과 전사활성 간의 hierarchy에서 상위에 있고, Leo1은 Upc2의 negative regulator로 기능한다. cdc73Δ에서 H3K4me3의 분포와 전사체 분석을 통해, Cdc73는 Yeast mating 때 필요한 pheromone signaling pathway 중 MAPK pathway 조절과 세포주기 조절에 중요하다는 사실을 확인하였다.

C. albicans의 병원성에 대한 Paf1C와 H3K4me3의 역할을 규명하기 위해 ctr9Δ/Δ, cdc73Δ/Δ, leo1Δ/Δ를 제작하였으며, 이 중 ctr9Δ/Δ만 병원성이 감소하는 것을 확인하였다. CTR9은 C. albicans growth와 대사 유전자 발현에 필수적인 역할을 하며, methionine biosynthetic pathway를 통해 C. albicans의 균사 형성과 병원성 결정에 영향을 준다. leo1Δ/Δ에서 methionine metabolism과 hyphal tip formation 관련 유전자들의 증가하고, Gcn4-mediated 유전자 발현이 WT 수준만큼 증가하지 않는 것을 보아, LEO1은 WT 병원성 경로 유지에 중요하고, 이때 yeast 조건 때 분포된 H3K4me3 양이 hypha induction에 의해 촉진되는 전사에 충분조건임을 확인하였다.

○ 2단계
● 연구 목표
1단계 결과를 통해, CTR9이 C. albicans의 병원성 유지에 중요하다는 사실을 확인하였다. 하지만 C. albicans 저항성과 숙주 면역 반응 사이의 상호작용은 C. albicans의 감염경로를 결정하는 정교한 미세환경을 만들기 때문에, 몇 가지 요소만 적용해 C. albicans의 병원성을 이해하고, 캔디다증 치료 표적 유전자를 제시하기에는 한계가 있다. 또한, 국내외 C. albicans의 병원성 연구가 활발해지면서, 대식세포와의 상호작용을 고려한 미세환경을 잘 구성하는 것을 중요성이 강조되고 있다.

따라서, 2단계 연구 목표는 C. albicans와 이를 삼킨 대식세포의 전사체를 동시에 분석하여, C. albicans-숙주 상호작용 과정에서 CTR9의 기능을 규명하고, 캔디다증 치료 표적 유전자를 제시하는 것이 최종 목표이다. 이를 위해 C. albicans와 C. albicans가 감염된 대식세포의 전사체를 동시에 분석하는 최적의 dual RNA-seq 조건 및 프로토콜을 확립하는 것이 필요하고, 이는 2단계의 세부 목표이다.

● 연구 내용
CTR9은 C. albicans의 병원성 유지에 필요한 요소임을 1단계 연구 수행을 통해 확인하였다. 이에, 대식세포에게 감염할 C. albicans로는 SC5314 WT과 ctr9Δ/Δ를 사용할 것이다. C. albicans가 감염된 대식세포의 dual RNA-seq 수행하기 위해 C. abicans의 MOI 및 균사 형성 시간 등을 최적의 조건으로 맞춘 실험 프로토콜을 확립해야할 필요가 있다.

Candida 감염 및 균사 형성의 최적 조건을 설정하기 위해, serum 없이 배지에서 Candida를 대식세포에 감염시킨 후 phagocytosis가 발생하도록 하고, 이후 hypha 형성에 따른 대식세포와의 상호작용을 확인하기 위해 serum이 포함된 배지에서 균사 형성을 유도하여, 각각의 조건에서 total RNA를 추출할 예정이다. 이 전체 프로세스는 tdTomato가 유전자에 삽입된 SC5314 WT 균주를 사용하고, 형광 현미경 관찰을 동반할 것이다. 또한, 터져버린 대식세포의 DNA에 결합하는 Draq7 dye와 Candida의 세포벽에 염색되는 Calcoflour-white를 사용하여, hypha 형성에 따른 대식세포와의 상호작용을 위한 조건을 잡을 것이다.

다음으로, C. albicans가 감염된 대식세포로부터 전체 RNA를 추출하고, library를 제작하여, sequencing을 진행한다. Sequencing reads를 species specific genome에 mapping하여, 대식세포와 C. albicans의 sequencing 결과를 분리하여, 데이터를 분석한다. 이를 통해, Candida의 yeast 형태 및 hypha 형태에 반응하는 대식세포의 면역 반응 유전자와 대식세포의 방어작용에 반응하는 C. albicans의 병원성 유전자를 선별하고, CTR9의 역할 및 캔디다증 치료 표적 유전자가 병원성에 미치는 영향을 확인할 예정이다.

□ 연구성과
1단계 (1-3차년도)
H3K4me3과 전사활성 사이의 메커니즘에 관한 연구로 논문 2편을 SCI급 저널에 투고하고, H3K4me3이 전사를 촉진함을 입증하고, Upc2의 negative regulator를 처음으로 제시하고, Leo1의 새로운 세포 내 기능을 확인하였다.
세포 분화 과정에서 Paf1C의 기능을 정리한 SCI급 논문 1편을 게재하고, S. cerevisiae의 mating pathway 조절과 세포주기 조절에 필수 요소라는 Cdc73의 세포 내 기능을 확장하였다.
C. albicans 병원성에 미치는 Ctr9의 기능에 대한 논문 1편을 SCI급 저널에 투고하고, C. albicans 병원성에 대한 Paf1C와 결손 균주에 남아있는 H3K4me3 역할을 처음으로 규명하였다.
2단계 (4,5차년도)
확립된 dual RNA-seq 프로토콜 논문과 C. albicans의 병원성-숙주 상호작용에 CTR9이 미치는 영향을 규명하고, 이에 대한 논문을 투고 및 게재하며, 최종적으로 캔디다증 치료 표적을 제시하고자 한다.

□ 연구성과의 활용 계획 및 기대효과
본 연구의 결과는 고콜레스테롤 혈증이나 이로 인한 암 발병 및 전이 연구를 수행하는 의학 및 생명과학 연구기관, 의료 및 진단 기업에 향상된 정보를 제공할 수 있다. 또, 히스톤 변형과 같은 후성유전학적 연구 결과는 많은 질병 연구에서 중요한 진단마커 개발에 활용 중이므로, 질병 치료 및 예방 전략 개발과 바이오 마커 식별 및 진단키트 개발에 기여할 수 있다.

후성유전학적 진단마커는 국내외 바이오 기업들이 활용하고 있으며, 환자 개개인의 특성을 고려한 진단과 치료를 할 수 있도록 한다. 따라서, 본 연구의 결과는 정확한 진단 및 맞춤형 치료에 기여하여, 치료 기간과 의료비용을 감소하도록 하고, 국가의 의료 예산에 부담을 덜어줄 수 있다. 또한, 국내 생명공학 산업의 성장을 촉진해, 고용 창출과 세계 시장에서 국내 기업이 경쟁력을 확보하는 데에 기여할 수 있다.

캔디다증은 기저 질환이 있는 환자나 면역력이 약한 환자에게 매우 위험하다. Candida와 숙주 면역 작용의 상호작용을 바탕으로 치료 표적 유전자를 찾는 것은 캔디다증 치료를 위한 신약 개발에 필요한 기초적인 자료를 제공하고, 이는 캔디다증 치료에 효율성을 높여 의료비용을 감소시키고, 국가 의료 예산 절감에 기여할 수 있을 것으로 예상한다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 6
• 1. 연구과제의 개요 ... 7
• 1) 연구과제의 최종 목표 및 필요성 ... 7
• 2) 연구과제의 주요내용 ... 7
• 2. 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 8
• 3. 연구과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 13
• 1) 연구수행 결과 ... 13
• 2) 목표 달성 수준 ... 13
• 3) 중요 연구변경 사항 ... 13
• 4. 연구성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 14
• 5. 연구성과의 관리 및 활용 계획 ... 14
• 1) 연구성과의 관리 추진 체계 ... 14
• 2) 예상되는 연구성과의 활용분야 ... 14
• 6. 다음 단계 연구계획 ... 14
• 1) 연구 목표 및 내용 ... 14
• 2) 연구 추진전략 ... 15
• 3) 연구 추진일정 및 기대성과 ... 16
• 4) 다음 단계 연구비 사용계획 ... 16
• 5) 연구 성과의 활용방안 및 기대효과 ... 16
• 끝페이지 ... 23