[보고서]혈소판단백질로 표면수식된 항암제 지질기반 나노입자와 PD-L1억제 유전자와의 복합체 제조를 통한 면역항암효능 증가

조정원

[국가R&D연구보고서] 혈소판단백질로 표면수식된 항암제 지질기반 나노입자와 PD-L1억제 유전자와의 복합체 제조를 통한 면역항암효능 증가
The improvement of immunocancer efficacy through the combination of paclitaxel-loaded nanostructured lipid carriers modified with platelet membrane and PD-L1 siRNA 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	충남대학교 Chungnam National University
연구책임자	조정원
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2024-03
과제시작연도	2023
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202400007272
과제고유번호	1711189919
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2024-09-10
키워드	면역항암.지질기반전달체.생체모방.혈소판단백질.PD-L1억제유전자.immunocancer.lipid based carrier.biomimetic.platelet membrane protein.PD-L1 siRNA.

초록 ▼

□ 연구개요
1) 최종연구목표 : PD-L1저해를 포함한 사중 제형 전략으로 면역항암요법을 위한 생체모방형 전달체 구축
2) 본 연구과제는 파클리탁셀의 지질나노입자와 PD-LI억제유전자의 병용요법을 시도하는데, 이 때 혈소판 단백질을 지질나노입자에 부착하여 암세포로의 표적지향성을 증가시키고, TPGS의 양친매성 계면활성제를 이용하여 면역보조제의 역할을 부여하면서 PD-LI억제유전자의 전달효율을 극대화하고자 하는 것을 목표로 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
1) 1년차: 파클리탁셀함유 지질나노입자의 혈소판으로 코팅(PTX-NLC-PT)후 암세포 및 암조직으로의 표적화 확인 - 파클리탁셀함유 지질나노입자와 혈소판을 코팅해 PTX-NLC-PT를 제조하고 물리화학적 특성 및 난소암세포에서 혈소판의 특성을 관찰함. (달성도 100%)
2) 2년차: PTX-NLC-PT과 PD-L1 siRNA (siP)의 복합체 제조 (PTX-NLC-PT-siP)후 PD-L1억제를 통한 T 세포 활성화 확인 - 파클리탁셀함유 지질나노입자에 PD-L1 siRNA 결합한 P-NLC-siRNA 복합체를 제조함. P-NLC-siRNA의 물리화학적 특성 및 세포 독성, T세포의 활성화 정도를 확인함. (달성도 100%)
3) 3년차: PTX-NLC-PT-siP과 TPGS제조 (PTX-NLC-PT-siP-T), 기준 및 시험방법 설정 및 안정성시험 - P-NLC-Chi제형을 통계학적으로 최적화한 후 PD-L1 siRNA와 결합한 최적의 제형을 제작함. P-NLC-Chi-siRNA의 물리화학적 특성 및 siRNA의 안정성 및 방출에 대한 시험법을 설정함. 파클리탁셀 및 siRNA의 세포 내 전달 가능성과 세포 독성, mRNA의 변화 정도를 확인함. (달성도 100%)
4) 4년차: PTX-NLC-PT-siP-T 약동학시험 및 조직분포시험 - MCF-7 세포와 MCF-7/ADR 세포를 이용하여 P-gp 관련 MDR1 유전자의 발현을 비교하고 제형의 P-gp 매개 다제내성 억제효과를 확인함. 파클리탁셀 대신에 Dir 형광 염료를 이용하여 제작한 체내 입자 분포의 형광 관측을 통해 in vivo상에서 P-NLC-Chi-siRNA의 조직분포를 확인함. (달성도 100%)
5) 5년차: PTX-NLC-PT-siP-T 동물실험을 통한 항암효능 및 면역활성시험 - TPGS로 표면수식되고 혈소판막으로 코팅된 PTPNs를 제조하고 물리화학적 특성 및 방출 특성, 세포 독성 및 흡수를 평가함. P-NLC-Chi-siRNA 및 PTPNs의 동물실험을 통한 항암효능 시험 및 면역활성시험을 수행함. (달성도 100%)

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
1) 암질환 및 면역능 향상을 위한 타겟 또는 바이오마커가 밝혀졌을 때, 이를 타겟하는 siRNA를 제조하게 될 것임.
2) siRNA전달은 생체 내 불안정성, 세포막 통과 어려움 등의 한계점을 가지고 있으므로 새로운 전달시스템의 필요성을 느끼게 될 것임.
3) 최근 들어 바이오테러 (보툴리누스 균, 탄저균 등) 등과 같은 위험적인 상황에 노출되었을 때에, 본 연구결과물은 이를 예방 또는 치료할 수 있는 기본 시스템을 제공할 수 있음.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
가. 최종연구목표 ... 4
나. 연구의 필요성 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
1) 연구 추진전략 및 방법 ... 4
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 5
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 5
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 13
3) 목표 달성 수준 ... 14
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 14
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 15
6. 자체점검표 ... 15
7. 참고문헌 ... 16
끝페이지 ... 37

표/그림 (39)

표 The solubility of PTX in (A), various liquid lipids; (B) various solid lipids; and (C) various 1% surfactant solutions (n=3, mean ± SD).
표 (A), Preparation of platelet, and identification of CD41 on P-PTX-NLC; (B), Electrophoresis followed by Coomassie staining; (C), Western blot analysis with antibody specific for CD41 (1:1000).
표 Physicochemical property of PTX-NLC, platelet and P-PTX-NLC. (A), particle size and PDI; (B), Zeta potential. (n=3, mean ± SD).
표 Transmission electron microscopy (TEM) image. (A), PTX-NLC; (B), P-PTX-NLC. Samples were negatively stained with uranyl acetate.
표 STEM-EDS image of P-PTX-NLC. (A), STEM image of P-PTX-NLC; (B), EDS mapping image of uranium elements; (C), STEM-EDS line analysis of uranium elements on P-PTX-NLC.
표 Confocal fluorescent microscopy images with anti-CD41 antibody (1:100) for SKOV-3 cell. (A), PTX-NLC; (B), P-PTX-NLC (blue= nuclear, red = F-actin, green = CD41).
표 (A), Observed particle size of P-NLC-siRNA complex; and (B), Change of particle size after the siRNA complexation.
표 Zeta potential of P-NLC-siRNA complex depend on the NLC/siRNA ratio (w/w).
표 Transmission electron microscopy (TEM) image. (A), PTX-NLC; (B), P-NLC-siRNA. Samples were negatively stained with uranyl acetate.
표 Results of materials for P-NLC, physical mixture, and P-NLC: (A), DSC; and (B), FT-IR.
표 Gel retardation test of P-NLC-siRNA complex depend on the w/w ratio of P-NLC/siRNA.
표 Cell viability results with PTX, B-NLC, P-NLC, and P-NLC-siRNA in MCF-7 cell after (A) 24 h and (B) 48 h treatment.
표 Effect of Paclitaxel in RAW 264.7 cells on (A), TNF-α; (B), IL-10; (C), IL-12 production.
표 Factors and responses used in Box-Behnken design
표 The experimental composition and observed responses through mixture design
표 Summary of suggested model and statistical parameters
표 Predicted and actual values of responses for the optimized P-NLC-Chitosan
표 3D surface plots of responses: (A), Particle size; (B), Polydispersity index; (C), Zeta potential.
표 (A) Observed particle size of P-NLC-Chi-siRNA complex and (B) Change of particle size after the chitosan and siRNA complexation.
표 Transmission electron microscopy images of P-NLC, P-NLC-Chi and P-NLC-Chi-siRNA.
$(A) Differential scanning calorimetry thermogram of GMS, PTX, Polox 188, SPC, Chitosan and P-NLC-Chi, (B) Fourier transform-infrared spectroscopy spectra, (C) X-ray diffraction pattern.$ 표 (A) Differential scanning calorimetry thermogram of GMS, PTX, Polox 188, SPC, Chitosan and P-NLC-Chi, (B) Fourier transform-infrared spectroscopy spectra, (C) X-ray diffraction pattern.
표 Change of zeta potential according to N/P ratio.
표 The gel retardation test with different ratio (w/w) of P-NLC-Chi and PD-L1 siRNA.
표 Stability of siRNA loaded P-NLC-Chi-siRNA against FBS after 24 h incubation.
표 The cumulative released % of PTX and PD-L1 siRNA. (A) Release of free PTX, P-NLC-Chi and P-NLC-Chi-siRNA for 168 h, (B) siRNA release profile from P-NLC-Chi-siRNA complex at different pH status, (C) Gel electrophoresis analysis of siRNA released from P-NLC-Chi-siRNA.
표 Cellular uptake of free coumarin 6, C-NLC-Chi (coumarin 6 loaded NLC), and C-NLC-Chi-siRNA (coumarin 6 loaded NLC and Cy5.5-PD-L1 siRNA complex) at 2 h in (A) MCF-7 cells, (B) MCF-7/ADR cells observed by fluorescence microscopy. (Scale bar = 75 μm) (C) Flow cytometry analysis of cellular uptake and quantitative analysis of the fluorescence intensity of free coumarin 6, C-NLC-Chi and C-NLC-Chi-siRNA at 2 h in MCF-7 cells, (D) MCF-7/ADR cells.
표 The cytotoxicity of B-NLC-Chi, B-NLC-Chi-siRNA, P-NLC-Chi and P-NLC-Chi-siRNA compared to free PTX against MCF-7/ADR cells for (A) 24 h, (B) 48 h and MCF-7 cells for (C) 24 h and (D) 48 h.
표 PD-L1 mRNA level of 10 nM siRNA transfection in (A) MCF-7/ADR and (B) MCF-7 after 24 h.
표 The effect of P-gp mediated multidrug resistance. (A), The MDR1 mRNA expression of MCF-7 and MCF-7/ADR cells; (B), The effect of P-NLC-Chi-siRNA on MDR1 mRNA expression in MCF-7/ADR cells; (C), P-gp activity assay of Rh 123 accumulation.
표 In vivo imaging of Dir-NLC-Chi-siRNA in MCF-7/ADR tumor bearing in nude mice. (A), Images measured at different time points for 24 h after IV injection of Free Dir and Dir-NLC-Chi-siRNA; (B), Ex vivo images of tumors and major organs after 24 h post injection; (C) Quantitative analysis of fluorescence images in tumors and major organs.
표 (A), Factors and responses used in Box-Behnken design; (B), The experimental composition and observed responses of TPNs.
표 3D surface plots of responses: (A), particle size; (B). encapsulation efficiency; (C) polydispersity index.
표 Physicochemical characterization of TPNs: (A), DSC; (B), FTIR; (C), XRD; (D), SEM image; E, TEM image.
표 The characterization of PTPNs: (A), Particle size and zeta potential of TPNs, PTPNs, and PM; (B), Coomassie blue stained SDS-PAGE gel; (C), CD41 bands in PM resolved using western blot; (D), TEM images of optimized PTPNs negatively stained with uranyl acetate.
표 In vitro release profiles of PTX from TPNs and PTPNs: (A), The cumulative released% of PTX from TPNs and PTPNs for 96 h in pH 4.5, 6.8, 7.4 buffer with 2% SDS (mean ± SD; n = 3). p values were calculated by Student's t test: *P < 0.05; (B) – (F), Release kinetic model fitting of PTX from TPNs and PTPNs using zero-order, first-order, Higuchi-, Hixson-Crowell, and Korsmeyer-Peppas models.
표 In vivo antitumor efficacy of control, Taxol, TPNs, and PTPNs in MCF-7/ADR tumor bearing nude mice: (A), Growth curves of tumor volume change when the each formulation was injected intravenously every 3 days. The red dotted line represents the time points of drug injection; (B), The body weight change of nude mice in each experimental groups; (C), Tumors collected from nude mice 14 days after treatment; (D), Average weight of tumors collected after 14 days of treatment.
표 In vivo antitumor efficacy of P-NLC-Chi-siRNA. (A) Tumor growth curve following different treatments. The arrows indicate the time points of drug treatment. (B) Average tumor weights in different groups. (C) Surgically removed tumor tissues from nude mice on day 14. (D) The body weight change of nude mice (E) PD-L1 mRNA levels in tumor tissues after treated with different formulations. The PD-L1 expression level was normalized to β-actin and analyzed.
표 In vivo safety evaluation of PTPNs: The TNF-⍺ levels in the serum of the MCF-7/ADR tumor bearing mouse.
표 In vivo safety evaluation of P-NLC-Chi-siRNA. (A), The IFN-γ and TNF-⍺ levels in the serum of the MCF-7/ADR tumor bearing mouse.

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