보고서 정보
주관연구기관 |
명지대학교 MyongJi University |
연구책임자 |
이정훈
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2024-03 |
과제시작연도 |
2023 |
주관부처 |
과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT |
연구관리전문기관 |
한국연구재단 National Research Foundation of Korea |
등록번호 |
TRKO202400008837 |
과제고유번호 |
1711181155 |
사업명 |
개인기초연구(과기정통부) |
DB 구축일자 |
2024-09-24
|
키워드 |
슈퍼내성균.카바페넴.콜리스틴.티게사이클린.내성유전자 검출.Super bug.Carbapenem.Colistin.Tigecycline.Detection of resistance gene.
|
초록
▼
□ 연구개요
본 연구실에서 정립한(선행연구) 항생제 내성유전자 분석 및 내성 메커니즘 분석 방법을 기반으로, (i) 최우선으로 연구해야하는 (WHO 2017년 보고서) 슈퍼내성균의 내성유전자 탐색; (ii) 슈퍼내성균의 내성유전자에 대한 Big Data 분석; (iii) Big Data 기반 내성유전자 검출 primer 고안; (iv) 슈퍼내성균의 내성유전자 검출을 위하여 고안된 primer의 적절성 test를 위한 clones 제작; (v) 고안된 항생제 내성유전자 검출 primer의 적절성 test로 슈퍼내성균의 내성유전자
□ 연구개요
본 연구실에서 정립한(선행연구) 항생제 내성유전자 분석 및 내성 메커니즘 분석 방법을 기반으로, (i) 최우선으로 연구해야하는 (WHO 2017년 보고서) 슈퍼내성균의 내성유전자 탐색; (ii) 슈퍼내성균의 내성유전자에 대한 Big Data 분석; (iii) Big Data 기반 내성유전자 검출 primer 고안; (iv) 슈퍼내성균의 내성유전자 검출을 위하여 고안된 primer의 적절성 test를 위한 clones 제작; (v) 고안된 항생제 내성유전자 검출 primer의 적절성 test로 슈퍼내성균의 내성유전자를 탐색할 수 있는 플랫폼 기술 개발이 목표임.
□ 연구 목표대비 연구결과
카바페넴(carbapenems) 및 콜리스틴(colistin) 내성유전자 출현 현황 분석은 2015년∼ 2022년 12월까지, 타이제사이클린(tigecycline) 내성 유전자 출현 현황 분석은 2019~2022년 12월까지 보고된 논문 및 학술 자료 등의 데이터베이스를 토대로 내성 균주의 출현 빈도 및 출현 국가를 조사.
국내대학병원으로부터 총 50종의 다제내성균주를 분양 받아 균주를 확보하였고, MIC 측정을 통하여 12종의 carbapenem계 내성 균주들과 3종을 콜리스틴(colistin) 내성 균주 및 1종의 타이제사이클린(tigecycline) 내성 균주를 선별하였음. 선별된 슈퍼내성균에 대한 선행연구를 통하여 개발된 bla detection kit를 사용하여 carbapemenase 유전자(VIM type 및 OXA-51 type)를 확인 하였음.
7종의 유전자[blaKPC-2, blaNDM-1, blaCMY-10, blaOXA-48, mcr-1, tet(X3) 및 tet(X4)]의 대량 발현 시스템을 구축하여, KPC-2, NDM-1, CMY-10, OXA-48, MCR-1, Tet(X3) 및 Tet(X4) 단백질들의 대량 발현 및 가용성 발현을 확인하였음. 7종의 내성 단백질들의 2단계의 순수분리 시스템을 도입하여 단백질 순수분리하였음.
4종의 내성 단백질들(KPC-2, NDM-1, CMY-10 및 OXA-48)에 대한 효소 특성 분석을 위하여 8종의 항생제(Ampicillin, Cephalothin, Cefoxitin, Cefotaxime, Ceftazidime, Imipenem, Meropenem 및 Ertapenem)에 대한 kinetic parameter를 측정하여 carbapenem을 분해하는 carbapenemase임을 확인하였고, Tet(X), Tet(X3) 및 Tet(X4)에 대한 tigecycline 분해 효과를 확인을 위한 catalytic efficiency를 확인한 결과 Tet(X)에 비하여 Tet(X3)와 Tet(X4)가 catalytic efficiency가 높아진 것을 확인하였음.
Serine-based β-lactamases(Class A, C 및 D: KPC-2, CMY-10 및 OXA-48)는 2 단계 과정을 통하여 β-lactam계 항생제를 가수분해 시키고, metallo-β-lactamases(class B: NDM-1)은 메탈 이온을 통하여 β-lactam계 항생제를 가수분해 시킴을 확인함. MCR-1과 같은 bacterial lipooligosaccharide PEAtransferase들은 두 개의 도메인으로 구성되었고, MCR은 Lipid A의 Lipid A의 1' 및 4' 인산염 군을 변형시키기 때문에 발생시키기 때문에 colistin에 대한 내성을 같게 됨을 확인함. Tigecycline은 Tet(X3) 및 Tet(X4)에 의해 항생 효과가 불활성화됨.
NCBI, PubMed의 database로부터 carbapenem 내성유전자 총 136종 1,743개에 대한 유전자 서열과 mcr 유전자 총 10종 107개와 tigecycline resistance 유전자 총 5종 12개에 대한 유전자 서열을 확보하였고, 확보된 내성유전자들을 Ambler 분류법에 따른 molecular class 별로 분류하고, 임상적으로 중요한 내성유전자들을 선별하여 유전자 서열을 분석하였음.
63종(carbapenemase 48종, tet 5종 및 mcr 10종)에 대한 primer 70쌍을 고안하였음. 63종의 내성유전자는 합성 및 분양을 통하여 들을 확보하여 T-vector cloning을 하고 이를 주형으로 고안된 70쌍의 primer들에 대한 검출 적절성을 확인하였음.
국내대학병원 및 국가병원체자원은행에서 타겟 carbapenemase 생성 임상균주(E. coli: 4종, Klebsiella: 5종, Pseudomonas: 3종, Acinetobacter: 4종, Citrobacter: 1종) 17종 및 reference 균주 13종을 확보하였음. multiplex PCR 방법을 기반으로 개발된 검출 플랫폼에서 그람음성 세균의 single colony로부터 빠르게 유전자를 추출하기 위해 선행연구에서 검증된 방법을 도입하였음. 다양한 taq DNA polymerase 및 primer 농도 테스트를 통하여 최적화 조건을 확립하였고, 최적화된 총 12개의 그룹으로 구성된 multiplex PCR primer 쌍들을 검증하였음.
슈퍼내성균의 내성유전자 검출 플랫폼을 검증하기 위해 총 30종의 균주(임상균주: 17종, reference 균주: 13종)를 대상으로 최종적으로 carbapenemase, mcr 및 tet의 검출 여무를 확인한 결과, 30개 균주 모두에서 목표로하는 내성유전자를 검출할 수 있었음.
□ 연구발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
슈퍼내성균의 내성유전자 검출 플랫폼은 사용 목적에 따라 질병선별표지자, 질병표지자, 예후표지자, 유효성표지자, 독성감별표지자 등으로 분류되어 질환진단, 조기진단, 맞춤의료, 약물평가와 개발, 위험성 평가를 통한 임상시험 단축, 잠재적 표적 의약품 개발 등 다양한 분야에 적용될 수 있음.
슈퍼내성균의 내성유전자 검출 플랫폼은 몇몇 타입과 MIC 값만 확인하던 기존 시장에서 내성 유전자를 보다 정밀하고 정확하게 검출 할 수 있는 솔루션을 제공할 수 있으므로 항생제 내성 검출/진단과 치료의 가이드라인으로 활용될 수 있을 것으로 기대됨. 또한 기술개발 과정에서 습득한 노하우성 기술을 응용하여 보다 개선된 검출 방법을 개발할 수 있으며, 국내 환경에 적합한 항생제 내성균 진단/검출 기술을 개발함으로써 항생제 내성균 확산 방어를 통하여 국민 건강 증진에 기여할 수 있을 것으로 기대됨. 또한, 항생제 내성의 빠른 진단이 가능해지고 불필요한 항생제 처방을 줄일 수 있어 사회 전체의 의료비를 절감할 수 있는 경제적인 효과도 있음.
한편 내성유전자 검출 관련 제품들은 최근까지도 국외 의존도가 높은 실정임. 항생제 내성 유전자 진단키트를 제품으로 출시할 경우에는 해외 수입 대체효과를 거둘 것으로 기대됨.
항생제 내성 유전자 검출 플랫폼 기술은 아이템 발굴 여부에 따라 무궁한 적용・활용 가능성을 가지고 있으며, 생태계 전반에서 항생제 내성균이 순환적으로 전파되고 있어 농·축·수산, 식품, 환경, 폐기물 등 다양한 분야로 그 적용 분야가 확산될 수 있음.
(출처 : 연구결과 요약문 2p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 연구결과 요약문 ... 2
- 목차 ... 3
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
- 1) 연구의 최종목표 ... 4
- 2) 연구의 필요성 및 범위 ... 4
- 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
- 1) 주요 연구 변경사항 ... 5
- 2) 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
- 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 16
- 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 16
- 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 17
- 3) 목표 달성 수준 ... 17
- 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 18
- 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 18
- 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
- 6. 자체점검표 ... 19
- 7. 참고문헌 ... 19
- 끝페이지 ... 61
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.