[보고서]세포내 칼슘 항상성 조절을 통한 치주염 발생기전 및 제어기반연구

이금화

[국가R&D연구보고서] 세포내 칼슘 항상성 조절을 통한 치주염 발생기전 및 제어기반연구
Calcium homeostasis and organelle function in the pathogenesis of periodontitis 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전북대학교 Chonbuk National University
연구책임자	이금화
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2024-03
과제시작연도	2023
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202400009456
과제고유번호	1711188621
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2024-10-02
키워드	소포체스트레스.칼슘대사.치주염.오토파지.TMBIM6.ER stress.Calcium metabolism.periodontitis.autophagy.

초록 ▼

□ 연구개요
❍ 세포 내 소기관 칼슘교신을 통한 새로운 치주염 병인기전 제시
- 세포 소기관내 칼슘 항상성 교신과 치주염발생과 제어의 의미연구
- ER stress와 세포내 소기관내 칼슘교신에 의한 치주염증질환의 원인을 분자수준에서 규명하고 동물모델을 이용하여 검증함으로써 이를 기초로 ER stress 및 세포소기관내 칼슘신호 제어를 통해 치주염증질환 치료제 개발의 과학적 근거기반을 제시하고자 함
- 치주질환 유발과정에서 치주조직 내 칼슘 항상성의 변화를 규명하여 새로운 치주염 병인기전을 규명하고자 함. 이를 기반으로 치주염 제어표적을 발굴하며, 발굴 표적을 기반으로 하는 치주염의 제어 가능성을 검증함.

□ 연구 목표대비 연구결과
❏ 고혈당으로 인한 타액세포에서 α -amylase 합성분비 억제모델 구축
○ 타액세포 HSG cell을 이용하여 고혈당 medium을 만성적으로 처리하여 스트레스모델 확립
① 소포체스트레스 유도 상태에 ER stress 증가 유도 제시
② ERO-1 및 PDI증가로 인한 산화적 스트레스 증가 상태 제시
② 라이소좀의 활성증가와 IRE-1조절과의 연관성을 규명하고자 함
③ 의미: 소포체 스트레스와 ERO-1,PDI 의미연구
❏ Streptozotocin으로 인한 당뇨모델에서 타액분비억제 동물모델구축
○ 설치류에 STZ 처리하여 당뇨모델 시 고혈당 야기하여 타액분비 억제 동물모델구축
① 혈액 내 고혈당으로 인한 만성적 질환유발은 타액분비억제가 야기됨
② 혈액 내 고혈당 야기로 인한 salivary gland의 ER stress연관성 재검증
③ 의미: in vitro 모델과 in vivo모델과의 연계성 연구
❏ 대사질환으로 인한 치주염모델 스트레스 구축
○ 고지방식이로 인한 고혈당 및 대사질환 모델
① 고혈당 스트레스모델 구축
② 대사질환과 치주염과의 연관성을 규명하고자 본 연구를 진행하였음
③ 의미: 대사염증과 치주염의 병리적 스트레스 의미 제시
❏ TMBIM6 WT과 KO mice에서 결찰로 인한 치주조직의 염증변화
-TMBIM6의 결찰 유발 치주염에서 산화 스트레스와 염증성 사이토카인 억제
-NF-kB-IkB signaling pathway로 인한 osteoclast분화 억제기전을 검증함
-TMBIM6은 RANKL에 의해 유발된 파골세포 형성 억제

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
- 본 과제의 핵심 토대인 치주염 발생기전을 세포소기관내 칼슘 항상성조절을 염증대사에서의 역할을 규명하는 것은 학문적으로 국내외 관련분야에서 알려지지 않은 독창적인 분야임,
- 치주염치료제개발 시 기초학문의 새로운 신호전달 네트워크로 세포소기관내 칼슘항상성 신호전달의 역할과 구강 내 염증유발이 규명된다면, 치추염 질환 분야에 학술적 기술적 파급효과를 가져오리라 예상됨.
- 치주세포에서 염증신호로부터 Endoplasmic reticulum과 lysosome을 통해 유리된 칼슘을 염증관련오토파고좀 형성 및 성숙에 필요한 인자로써 제시하며 오토파지의 새로운 기전을 밝혀 치주 질환등의 치료법개발에 기여할 수 있을 것임

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 4
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 4
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 13
3) 목표 달성 수준 ... 13
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 13
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 14
6. 자체점검표 ... 14
7. 참고문헌 ... 15
끝페이지 ... 22

표/그림 (10)

표 High concentrations of glucose increased α-amylase synthesis and secretion in human salivary gland cells. Cells were exposed to different glucose concentrations (2.5, 5, 10, 20 or 40 mM) for 24 h. Amylase activity (A) and expression (B) were measured in cell lysates and the conditioned medium. Quantification of the expression is shown in the lower panel. Western blotting was performed on the cell lysates using anti-p-IRE-1, IRE-1, GRP78, CHOP, p-eIF2α, eIF-2α, ATF-6α, and β-actin antibodies (C). Spliced XBP-1 was analyzed with RT-PCR assay, as shown in the lower panel. Quantification of the p-IRE-1/IRE-1 expression ratio or the PDI and ERO-1α ratio is shown in the right panel. Oxyblotting (D) and disulfide bond formation (E) were analyzed as described in the Materials and Methods. Immunoprecipitation and immunoblotting were performed with anti-IRE-1α or GRP78 antibody (F). *p<0.05, compared with 2.5 mM glucose
표 IRE-1 phosphorylation mutation reduced α-amylase synthesis and secretion in glucose-exposed human salivary gland cells. Cells were transfected with IRE-1WT or IRE1599A, and Western blotting was performed using an anti-IRE1 antibody (A, left). Cells were exposed to different glucose concentrations (2.5, 5, 10, 20 or 40 mM) for 24 h. Alpha-amylase activity (A) and expression (B) were measured in both the cell lysates and the conditioned medium. Western blotting were performed on the cell lysates using anti-p-IRE1, IRE1, GRP78, CHOP, p-eIF2α, eIF-2α, ATF-6α, and β-actin antibodies (C). Spliced XBP-1 was measured with RT-PCR assay, as shown in the lower panel. Oxyblotting and quantification were also performed (D). Disulfide bond formation is shown in the right panel. *p<0.05, compared with the same concentration of glucose-exposed IRE1αWT-transfected cells
$Lysosomal activity was increased in human salivary gland cells that were chronically exposed to glucose. Cells were exposed to 40 mM glucose for the indicated time periods, and electron microscopy was performed as described in the Materials and Methods (A). Cells were treated with 40 mM glucose for 0 day (a), 1 day (b), 2 days (c), 3 days (d), 5 days (e), and 7 days (f); “N” indicates nucleus, “m” indicates mitochondria, “ER” indicates ER, and the arrow indicates the lysosome. Lysosome number was quantified at 0, 1, 2, 3, 5, and 7 days (B). Cells were exposed to 40 mM glucose for the indicated time periods, and were subsequently exposed to 5 μM LysoTracker and photographed (C). Fluorescence intensity and volume were quantified (right). Lysosome fractionation was performed on the 40 mM glucose-treated cells and β -galactosidase, β-glucuronidase, and α-mannosidase expression were analyzed (D). *p<0.05, compared with 40 mM glucose at 0 h.In panels A, B, C and D, each value is expressed as the mean ± S.E.M. for all three independent experiments$ 표 Lysosomal activity was increased in human salivary gland cells that were chronically exposed to glucose. Cells were exposed to 40 mM glucose for the indicated time periods, and electron microscopy was performed as described in the Materials and Methods (A). Cells were treated with 40 mM glucose for 0 day (a), 1 day (b), 2 days (c), 3 days (d), 5 days (e), and 7 days (f); “N” indicates nucleus, “m” indicates mitochondria, “ER” indicates ER, and the arrow indicates the lysosome. Lysosome number was quantified at 0, 1, 2, 3, 5, and 7 days (B). Cells were exposed to 40 mM glucose for the indicated time periods, and were subsequently exposed to 5 μM LysoTracker and photographed (C). Fluorescence intensity and volume were quantified (right). Lysosome fractionation was performed on the 40 mM glucose-treated cells and β -galactosidase, β-glucuronidase, and α-mannosidase expression were analyzed (D). *p<0.05, compared with 40 mM glucose at 0 h.In panels A, B, C and D, each value is expressed as the mean ± S.E.M. for all three independent experiments
표 Submandibular immunohistochemistry analysis in diabetic rats. H STZ, streptozotocin
표 고지방식이로 인한 고혈당 대사 질환모델
표 고지방식이로 인한 고혈당 대사 시 치주염 질환모델에서의 염증발현
표 TMBIM6 attenuates the destruction of periodontal tissue in a mouse model of periodontitis. Periodontitis was induced by a 6-0 sterile silk ligature placed inside the gingival sulcus in 8-week-old mice for 7 days. (A) Three-dimensional volume reconstruction images of the left maxilla of mice analyzed by micro-CT scans showed that TMBIM6 WT could attenuate bone loss in the alveolar ridge. Multiplanar reconstructions on the mesiodistal plane of the left maxilla of mice. The length from buccal to lingual was 500 μm. (B) HE staining showing pathological alterations in mouse periodontium samples derived from different groups (magnification, ×100; scale bar, 50 μm).(C) Percentage of TRAP-positive cells in the bone surface was calculated.(D) Distance between the CEJ and ABC on the distal side of the second maxillary molar was determined using HE-stained frontal sections. (E) Bone volume in the alveolar ridge of the left maxillary second molars was analyzed using the micro-CT scans.Data are presented as the mean ± SD (n=5/group). #P<0.05, vs. control; *P<0.05, vs. TMBIM6 WT, WT, wild-type; KO, knockout; CT, computed tomography; HE, hematoxylin-eosin; CEJ, cementum-enamel junction; ABC, alveolar bone crest; BV/TV, bone volume-to-total volume ratio
표 TMBIM6 reduces serum cytokine levels and gingival tissues in a mouse model of periodontitis. (A) Serum cytokine levels for TNF-a, IL-6, and IL-1 were measured. (B) Immunohistochemical staining of maxillary paraffin sections was used to evaluate the expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α (magnification, ×400). Statistical analysis of the percentage of tissue area positive for IL-1β, IL-6 and TNF-α in the gingiva. Data are presented as the mean ± SD (n=5/group). *P<0.05, vs. control; #P<0.05, vs. WT. WT, wild-type; KO, knockout; IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor
표 TMBIM6 inhibit pro-inflammatory mediators and oxidative stress in ligature-induced periodontitis. (A) iNOS and COX-2 were detected by Western blotting. (B,C)Malondialdehyde (MDA) levels were analyzed as described in Materials and Methods. Immunohistochemistry was performed with the 8-hydroxyguanosine (8-OHdG).(C) NF-κB, IκB and were detected by Western blotting. (D) IL-6,IL-1β and TNF-α ,were detected by Western blotting
표 TMBIM6 inhibits osteoclastogenesis through the Ca2+-NFATc1 axis. (A-B) TMBIM6 WT or TMBIM6 KO BMMs were cultured in the presence of RANKL and M-CSF for 3 days and stained for TRAP. The number of TRAP+ multinucleated cells with more than 3 or 10 nuclei are presented. MNC, multinucleated cells. Scale bar, 200 μm. BMMs isolated from TMBIM6 WT and TMBIM6 KO mice were cultured with the osteoclastogenic medium for 2 days. The mRNA levels of indicated genes were analyzed by RT-PCR. (C) Total lysates of TMBIM6 WT and TMBIM6 KO BMMs cultured under osteoclastogenic conditions for 2 days were subjected to western blotting. IL-6,IL-1β and TNF-α were detected by Western blotting. (D) mRNA expression of inflammation-related markers in each group

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