[보고서]철분에 의한 중간엽줄기세포의 분화조절에서 melanotransferrin의 작용

강동철

보고서 정보
주관연구기관	한림대학교 HalLym University
연구책임자	강동철
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2024-03
과제시작연도	2022
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202400009898
과제고유번호	1711172700
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2025-01-20
키워드	중간엽줄기세포.골모세포.단클론항체.면역반응.mesenchymal stem cell.MELTF.osteoblast.monoclonal antibody.immune response.

초록 ▼

◻ 연구개요
• 연구목표: MELTF가 세포외철분농도변화에 따른 골모세포 분화조절과 관련된 신호전달계를 조절하는 단백질일 것이라는 가설에 기반하여 철분에 의한 중간엽줄기세포의 골모세포로의 분화조절에서 철분결합단백질인 MELTF의 역할과 작용기전을 구명함.
• 철분농도 변화에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 사멸, 분화조절: 철분투여 및 철분결핍에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 반응성산소화합물에 의한 세포사멸, 골모세포로의 분화도를 측정하였음.
• 철분농도에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 사멸, 골모세포로의 분화조절에서 ME

◻ 연구개요
• 연구목표: MELTF가 세포외철분농도변화에 따른 골모세포 분화조절과 관련된 신호전달계를 조절하는 단백질일 것이라는 가설에 기반하여 철분에 의한 중간엽줄기세포의 골모세포로의 분화조절에서 철분결합단백질인 MELTF의 역할과 작용기전을 구명함.
• 철분농도 변화에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 사멸, 분화조절: 철분투여 및 철분결핍에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 반응성산소화합물에 의한 세포사멸, 골모세포로의 분화도를 측정하였음.
• 철분농도에 따른 중간엽줄기세포의 생장, 사멸, 골모세포로의 분화조절에서 MELTF의 작용: MELTF 전체, mMELTF, sMELTF 아형의 발현을 억제한 세포에서 중간엽줄기세포의 생장, 반응성산소화합물에 의한 세포사멸, 골모세포로의 분화도를 측정하였음
• MELTF의 발현억제에 따른 유전자 발현양상의 변화 분석: MELTF의 발현을 억제한 세포에서 전사체를 RNA-Seq으로 분석하였고 MELTF 발현억제에 따라 면역반응에 관련된 유전자의 발현이 감소됨을 확인함.
• 항 sMELTF에 대한 단클론항체 제작: sMELTF에 특이적인 단클론항체 2종을 생산하였고 항체의 탐지기능을 웨스턴블럿, 면역형광염색법으로 검증함.

◻ 연구 목표대비 연구결과
• 철분농도에 따른 줄기세포 생장, 사멸 및 분화: 철분농도를 조절하고 중간엽줄기 세포의 생존세포량, 세포사멸, 골모세포 분화도를 측정. 철분공급이 세포증식을 증가시키나 반응성산소화합물에 의한 세포사멸은 촉진하며 칼슘침착은 감소시킴.
• 철분에 의한 골모세포 분화조절에 관여하는 신호전달계: 철분농도를 조절한 세포에서 분화를 유도하고 분화관련유전자 RUNX2, DLX5의 발현을 분석함.
• 철분에 의한 골모세포의 분화조절에서 MELTF의 작용: MELTF의 발현을 억제한 세포에서 철분농도를 조절하고 중간엽줄기세포의 생존세포량, 반응성산소화합물에 의한 세포사멸, 골모세포 분화도를 측정. MELTF의 존재가 철분농도변화에 따른 세포증식, 사멸, 골모세포로의 분화를 유의미하게 변화시키지 않음.
• MELTF 작용기전_신호전달물질의 생성, 전사인자 분석, 신호전달계 요소간의 상호작용: MELTF의 발현을 억제한 세포에서 골모세포 분화조절유전자 및 분화조절 물질의 발현을 확인함.
• MELTF 작용기전_분자구조: 철분결합부위 돌연변이체인 MELTF/D78A 생산
• MELTF 유전자결손 생쥐: MELTF가 철분에 의한 분화조절에 관여하지 않는 것으로 밝혀져 수행하지 않음.
• MELTF의존성 유전자 형질발현(추가): MELTF의 발현을 억제한 세포의 유전자발현양상을 RNA-Seq로 분석하고 검증함. MELTF의 발현이 억제된 세포에서 항바이러스면역반응에 관련된 유전자의 발현이 감소됨을 확인함.
• 항 sMELTF 단클론항세 생산(추가): MELTF 아형을 탐지하고 기능을 분석하는데 필요한 sMELTF 단클론항체 2종을 생산하고 탐지능을 확인함.

◻ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
• MELTF가 철분에 따른 중간엽줄기세포의 분화조절에는 유의미하게 관여하지 않는다는 사실을 밝힘.
• MELTF의 작용에 대한 새로운 가설이 필요한 단계에서, 유전자 발현양상 분석을 통하여 MELTF가 항바이러스 면역반응에 조절할 수 있다는 연구결과는 MELTF 연구에 새로운 연구방향을 제시함. MELTF에 의한 면역반응조절에 관한 연구는 영향력있는 학술지에 발표할 수 있을 것으로 생각함.
• 생산된 항 sMELTF 단클론항체는 암 및 Alzheimer성 치매에서 증가되는 MELTF의 성상을 명확히 구명하는데 이용될 수 있음. 연구결과에 따라 진단표지자를 탐색하는데 사용될 수 있으며 또한 기존 MELTF연구의 문제점인 아형특이적인 현상을 연구하는데 이용될 것임. 항체의 상용화를 통한 수익창출도 가능할 것임.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구의 목적 ... 4
2) 연구의 필요성 ... 4
3) 연구가설 및 최종목표 ... 5
4) 연구범위 ... 5
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 6
1) 철분농도 변화에 따른 중간엽줄기세포의 생장 및 사멸 ... 6
2) 철분농도 변화에 따른 중간엽줄기세포의 분화 ... 6
3) 철분농도에 따른 중간엽줄기세포의 분화조절에서 MELTF의 작용 ... 7
4) MELTF의 발현억제에 따른 유전자 발현양상의 변화 분석 ... 9
5) 분비성 MELTF에 대한 단클론항체 제작 ... 9
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 11
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 11
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 12
3) 목표 달성 수준 ... 12
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 12
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 13
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 13
6. 자체점검표 ... 13
7. 참고문헌 ... 14
끝페이지 ... 20

표/그림 (7)

표 철분농도조절에 따른 중간엽줄기세포의 분화. A. FeCl3 또는 deferoxamine (DFeA)을 처리한 세포의 골모 세포로의 분화를 유도한 다음 7일차에 alkaline phosphatase 활성을 측정. B. 14일차에 Alizarin red로 염색. C. 분화유도 3일차에 RUNX2, DLX5의 발현을 웨스턴블럿으로 확인
표 siRNA를 도입하여 MELTF전체, mMELTF(CD228 V1), sMELTF(CD228 V2)의 발현을 억제한 중간엽줄 기세포에서 철분농도를 조절(FeCl3 또는 deferoxamine 처리)에 따른 생장, 반응성산소화합물에 대한 반응, 골모세 포로의 분화도 변화를 측정함. A. 일별 생존세포량을 MTT assay로 측정. B. 반응성산소화합물을 생성하는 H2O2 24시간 처리 후 생존세포량을 MTT assay로 측정. C. 골모세포 분화유도 7일차에 alkaline phosphatase 활성 측정. D. 골모세포 분화유도 14일차에 Alizarin red 염색정도 측정
표 siRNA를 이용하여 MELTF의 발현을 억제한 세포의 골모세포로의 분화를 유도함. A. 분화유도 3일, 5일차에 RUNX2, DLX5의 발현을 웨스턴블럿으로 확인. B. MELTF의 발현을 억제하고 Wnt 및 BMP 신호전달 저해제를 처리한 세포에서 RUNX2, DLX5 발현을 웨스턴블럿으로 확인. C. MELTF의 발현을 억제한 세포에서 Wnt, BMP mRNA의 발현을 RT-PCR로 분석. D. siRNA로 MELTF 두 전사체 아형의 발현을 특이적으로 억제한 세포에서 RUNX2, DLX5 발현을 웨스턴블럿으로 확인
표 siRNA를 이용 MELTF의 발현을 억제한 세포의 유전자발현양상을 QuantiSeq-3’-mRNA-Seq로 분석. A. 전체 유전자발현양상의 Volcano plot. 적색-2배 이상 증가. 녹색-2배 이상 감소. B. 발현정도가 2배 이상 변화하는 359종 유전자의 gene oncology enrichment 분석
표 RNA-Seq에서 2배 이상 발현이 차이가 나는 359종 유전자간의 상호작용을 STRING로 분석. Defense mechanism, mesenchyme migration, integrin-mediated signaling 등 3개의 집단으로 구분되고 defense mechanism 관련유전자는 IFN signaling, Ag processing and presentation, DNA cytosine deamination 3개의 집단으로 나누어짐
표 A. RNA-Seq에서 2배 이상 발현이 차이가 나는 일부 유전자의 발현을 실시간 RT-PCR로 분석. B. MELTF 발현을 억제한 세포에서 TRAIL-R2(DcR2)의 발현을 웨스턴블럿으로 확인. C. MELTF 발현을 억제한 세포의 TRAIL에 대한 반응성을 일별로 MTT assay로 분석
표 A. HEK293T세포에 mMELTF, sMELTF의 발현하는 재조합플라즈미드를 도입하고 이들의 발현을 생산된 단클론항체(2F2, 3H11)를 이용하여 웨스턴블럿으로 확인. B. 2F2 단클론항체와 HA-표지 항체를 이용하여 HA-sMELTF의 발현을 면역형광염색법으로 확임

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