Chlamydia trachomatis(C. trachomatis)는 인체에 트라코마, 결막염, 비임균성뇨도염, 부고환염, 자궁경관염, 나팔관염, 성병성 육아종 및 영유아폐염 등 다양한 질환을 일으킨다. C. trachomatis는 obligatory intracellular parasite로 특유의 생활사를 갖고 있어 균체 배양에 많은 어려움이 있다. C. trachomatis의 진단은 세포배양을 이용한 균체 배양법이 아직 표준진단 방법으로 되어있으나 시설 및 기술면에서 어려운점이 많아 일반 검사실에서 시행하기는 어렵다. 그외에 단세포군 항체를 이용한 직접 ...
Chlamydia trachomatis(C. trachomatis)는 인체에 트라코마, 결막염, 비임균성뇨도염, 부고환염, 자궁경관염, 나팔관염, 성병성 육아종 및 영유아폐염 등 다양한 질환을 일으킨다. C. trachomatis는 obligatory intracellular parasite로 특유의 생활사를 갖고 있어 균체 배양에 많은 어려움이 있다. C. trachomatis의 진단은 세포배양을 이용한 균체 배양법이 아직 표준진단 방법으로 되어있으나 시설 및 기술면에서 어려운점이 많아 일반 검사실에서 시행하기는 어렵다. 그외에 단세포군 항체를 이용한 직접 면역형광법, 효소면역 측정법 등이 상품화 되어 있으나 값이 고가이고 민감도 및 특이도가 각 검사실 마다 다양하다. 최근 배양이 어려운 균종에서 핵산보합결합(nucleic acid hybridization)이나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)법 및 연기서열결정(sequencing)등의 분자생물학적인 방법이 진단에 사용되고 있으나 아직 C. trachomatis의 plasmid에 대한 특성은 잘 알려져 있지 않다. 이에 연구자는 C.trachomatis의 plasmid에 대한 특성을 밝히고자 다음과 같은 연구를 실시하였다. 실험에 사용한 C. trachomatis의 표준균주는 A/HAR-13, B, B/HAR-36, Ba/Aphache-2, C/CDC, D/UW-3/Cx, E/Bour, F/lC-Cal-3,G/UW-57/Cx, H/UW-43/Cx, I/UW-12/UR, J/UW-36/UR, K/UW-31/Cx, LGV type I/440, LGV type II/CDC, LGV typeIII/404 였다. 특이도 검사를 위하여 C.pneumonia(TW 183), Staphylocoddus aureus, Staphylococcus epidermidis, gram positive bacilli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterobacter cloacae, Acinetobacter lwo ffi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, 및 Klebsiella pneumoniae를 사용하였다. 검체채취는 cotton-tipped swab을, 수송배지는 2SP(0.2M sucrose, 0.2M phosphate)를 사용하였다. C. trachomatis는 McCoy 단층세포에 검체를 접종후 cyclohexamide(1μg/ml)가 함유된 배지를 사용하여 48시간 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 기본체(elementary body)는 100% 배양된 C.trachomatis를 30% Renograffin을 이용한 differential centrifugation으로 순수 분리하였다. C.trachomatis의 plasmid는 국내에서 분리된 D/HY_(1212)/Cx의 기본체를 QIA prep-spin kit(QIAGEN,USA)로 분리하였고, QIAEX(QiAGE, USA)를 이용하여 agarose에서 순수분리 정제하였다. BamHI으로 제한 효소처리한 plasmid DNA는 BamHI으로 자른 pUC_18을 alkaline phosphatase 처리후 연결(ligation) 하였다. 연결된 pUC_18은 E.coli(JM_83)에 형질 변형시켜 Amp^r, β-galactosidase negative인 집락을 colony hybridization하여 recombinant pUC_18을 취사 선택하였다. 환자 검체는 우선 세포배양에 상청액을 사용하고 나머지 검체를 proteinase K alkaline solution 내에서 끓여 96well Bio-Dot apparatus(Bio-Rad, USA)를 이용 Nytran-plus에 dotting 하였다. Dotting된 Nytran plus는 공기중에서 건조후 전보합결합(prehybridization)을 65℃ 6x SSC 용액내에서 2시간 실시 하였다. 사용된 probe(_(p)CT_(D)R)는 recombinant pUC_18을 E.coRl과 Hind III로 절단하여 1.2Kb의 recombinant DNA를 Random Primed DNA Labelling kit(Baehringer Manheim Biochemical, Germany)를 사용 {a^(32)-P]dCTP를 labeling하여 사용하였다. 보합결합(Hybridization)은 65℃에서 6x SSC 용액내에서 18시간 실시하였으며 실험 결과는 다음과 같다. 1. C.trachomatis(D/HY_(12l2)/Cx 및 LGV type II/CDC)는 7.5Kb 크기의 plasmid를 갖고 있었다. 2. Recombinant plasmid는 BamHI, XhoI, SmaI, 및 Bgl II의 절단부위가 있었다. 3. pCT_DR의 예민도는 C.trachomatis DNA 1 pg까지 측정 가능하였다. 4. pCT_DR는 15종의 Chlamydia 혈청형과 모두 반응하였다. 5. pCT_DR는 C.Pneumonia 및 10종의 일반 세균과는 반응치 않았다. 6. 임상검체 58예중 3예는 세포배양 및 pCT DH에 양성, 1예는 세포배양 음성, pCT_DH 양성이었다. 54예는 세포배양 및 pCT_DH에 모두 음성이였다. 7. PCR 결과는 pCT_DH의 결과와 일치하였다. 상기 결과를 종합하면 연구자가 제조한 C.trachomatis의 plasmid probe (pCT_DH)는 임상실험에 사용한 결과 100%의 예민도와 특이도를 나타내었다.
Chlamydia trachomatis(C. trachomatis)는 인체에 트라코마, 결막염, 비임균성뇨도염, 부고환염, 자궁경관염, 나팔관염, 성병성 육아종 및 영유아폐염 등 다양한 질환을 일으킨다. C. trachomatis는 obligatory intracellular parasite로 특유의 생활사를 갖고 있어 균체 배양에 많은 어려움이 있다. C. trachomatis의 진단은 세포배양을 이용한 균체 배양법이 아직 표준진단 방법으로 되어있으나 시설 및 기술면에서 어려운점이 많아 일반 검사실에서 시행하기는 어렵다. 그외에 단세포군 항체를 이용한 직접 면역형광법, 효소면역 측정법 등이 상품화 되어 있으나 값이 고가이고 민감도 및 특이도가 각 검사실 마다 다양하다. 최근 배양이 어려운 균종에서 핵산보합결합(nucleic acid hybridization)이나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)법 및 연기서열결정(sequencing)등의 분자생물학적인 방법이 진단에 사용되고 있으나 아직 C. trachomatis의 plasmid에 대한 특성은 잘 알려져 있지 않다. 이에 연구자는 C.trachomatis의 plasmid에 대한 특성을 밝히고자 다음과 같은 연구를 실시하였다. 실험에 사용한 C. trachomatis의 표준균주는 A/HAR-13, B, B/HAR-36, Ba/Aphache-2, C/CDC, D/UW-3/Cx, E/Bour, F/lC-Cal-3,G/UW-57/Cx, H/UW-43/Cx, I/UW-12/UR, J/UW-36/UR, K/UW-31/Cx, LGV type I/440, LGV type II/CDC, LGV typeIII/404 였다. 특이도 검사를 위하여 C.pneumonia(TW 183), Staphylocoddus aureus, Staphylococcus epidermidis, gram positive bacilli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterobacter cloacae, Acinetobacter lwo ffi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, 및 Klebsiella pneumoniae를 사용하였다. 검체채취는 cotton-tipped swab을, 수송배지는 2SP(0.2M sucrose, 0.2M phosphate)를 사용하였다. C. trachomatis는 McCoy 단층세포에 검체를 접종후 cyclohexamide(1μg/ml)가 함유된 배지를 사용하여 48시간 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 기본체(elementary body)는 100% 배양된 C.trachomatis를 30% Renograffin을 이용한 differential centrifugation으로 순수 분리하였다. C.trachomatis의 plasmid는 국내에서 분리된 D/HY_(1212)/Cx의 기본체를 QIA prep-spin kit(QIAGEN,USA)로 분리하였고, QIAEX(QiAGE, USA)를 이용하여 agarose에서 순수분리 정제하였다. BamHI으로 제한 효소처리한 plasmid DNA는 BamHI으로 자른 pUC_18을 alkaline phosphatase 처리후 연결(ligation) 하였다. 연결된 pUC_18은 E.coli(JM_83)에 형질 변형시켜 Amp^r, β-galactosidase negative인 집락을 colony hybridization하여 recombinant pUC_18을 취사 선택하였다. 환자 검체는 우선 세포배양에 상청액을 사용하고 나머지 검체를 proteinase K alkaline solution 내에서 끓여 96well Bio-Dot apparatus(Bio-Rad, USA)를 이용 Nytran-plus에 dotting 하였다. Dotting된 Nytran plus는 공기중에서 건조후 전보합결합(prehybridization)을 65℃ 6x SSC 용액내에서 2시간 실시 하였다. 사용된 probe(_(p)CT_(D)R)는 recombinant pUC_18을 E.coRl과 Hind III로 절단하여 1.2Kb의 recombinant DNA를 Random Primed DNA Labelling kit(Baehringer Manheim Biochemical, Germany)를 사용 {a^(32)-P]dCTP를 labeling하여 사용하였다. 보합결합(Hybridization)은 65℃에서 6x SSC 용액내에서 18시간 실시하였으며 실험 결과는 다음과 같다. 1. C.trachomatis(D/HY_(12l2)/Cx 및 LGV type II/CDC)는 7.5Kb 크기의 plasmid를 갖고 있었다. 2. Recombinant plasmid는 BamHI, XhoI, SmaI, 및 Bgl II의 절단부위가 있었다. 3. pCT_DR의 예민도는 C.trachomatis DNA 1 pg까지 측정 가능하였다. 4. pCT_DR는 15종의 Chlamydia 혈청형과 모두 반응하였다. 5. pCT_DR는 C.Pneumonia 및 10종의 일반 세균과는 반응치 않았다. 6. 임상검체 58예중 3예는 세포배양 및 pCT DH에 양성, 1예는 세포배양 음성, pCT_DH 양성이었다. 54예는 세포배양 및 pCT_DH에 모두 음성이였다. 7. PCR 결과는 pCT_DH의 결과와 일치하였다. 상기 결과를 종합하면 연구자가 제조한 C.trachomatis의 plasmid probe (pCT_DH)는 임상실험에 사용한 결과 100%의 예민도와 특이도를 나타내었다.
The organisms of Chlamydia trachomatis cause ocular disease(trachoma, conjunctivitis) and genital infections (urethritis, epididymitis, cervitis, salpingitis, lymphogranuloma venerum), and infantile pneumonia. During the unique developmental cycle of this obligatory intracellular parasite, the infec...
The organisms of Chlamydia trachomatis cause ocular disease(trachoma, conjunctivitis) and genital infections (urethritis, epididymitis, cervitis, salpingitis, lymphogranuloma venerum), and infantile pneumonia. During the unique developmental cycle of this obligatory intracellular parasite, the infectious elementary body is transformed into a larger reticulate boby. Definitive diagnosis of Chlamydial infections is usually made by isolation of infectious organisms in cell culture or direct demonstration of specific antigens in inflammatory exutate using monoclonal antibody staining. Both methods, although specific and sensitive, need for special equipments for evaluation of test results and are therefore time consuming and require a trained specialist. Diagnostic detection of specific DNA sequences by nucleic acid hybridization has recently been introduced for several microorganisms. Current knowledge of the chlamydial cryptic plasmid is relatively limited. So we made plasmid probe (pCTDH), and used it to detect C.trachomatis in clinical specimens. C.trachomatis strains of A/HAR-13, B/HAR-36, D/UW-3/Cx, E/Bour, F/IC-Cal-3, G/UW-57/Cx, H/UW-43/Cx, I/UW-12/UR, J/UW-36/UR, K/UW-31/Cx, LGV type 1/440, and LGV type[U/404 were obtained from American Type Culture Collection(ATCC). Strains of serova C, LGV type 11, and C. pneumoniae(TWAR) were obtained from CDC. Control microbial strains were obtaind from routine isolation and identified by standard procedure. The strains included Staphylococcus aureus, staphylococcus epidermidis, gram positive bacilli, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes, Enterobacter cloacae, Acinetobacter lwofjf, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae. Male urethral and female cervical specimen were taken with cotton-tipped swabs into transport medium 2SP, and C.trachomatis were isolated in McCoy cells monolayer. Elementary bodies were purified by differencial centrifugation in 30% renograffin. The plasmid were isolated from C.trachomatis D/Hy1212/Cx by QIA prep-spin kit(QIAGEN, USA) and QIAEX(QIAGEN, USA). BamHI digested plasmid DNA was ligated into BamHI digested dephosphorylated pUC18 and transformed into E.coli(JM83). Colonies expessing AMPr but not /3 -galactosidase were selected and subjected to mini-plasmid analysis. For the hybridization assay, the specimen were treated with proteinase K and boiled in alkaline solution. The lysates were blotted onto Nytran-plus using 96 well Bio-Dot Apparatus(Bio Rad, USA). The Nytrans-plus was air dried and prehybridized for 2h at 65C in 6x SSC supplemented with 5x Denhart's solution and O.lmg salmon sperni DNA ml-1. The plasmid probe(pCTDH) was labelled with [a_32 P by random labelling kit(Baehringer Manheim Biochemical ;Germany), and the Nytran-plus hybridized overnight at 65'C. We found following results. 1. Ctrachomatas (D/HY1212/Cx, and LGV typeII/CDC)had a 7.5Kb plasmid. 2. Recombinant plasmid DNA had cleavage sites by BamHI, XhoI, SmaI, BgllI. 3. The sensitivity of pCTDH was less than 1 pg of whole DNA. 4. The pCTDH reacted with all 15 serovars of Ctrachomatis. 5. No reaction with C. pneumoniae(TWAR) and 10 general microbes were appeared. 6. The pCTDH probe recognized four of 58 specimens, and one of them was culture negative. 54 samples were both negative of culture and pCTDH. 7. The results of PCR were same as the results of pCTDH. In conclusion, we made a very sensitive and specific plasmid probe(pCTDH) for the detection of C.trachomatis from clinical samples.
The organisms of Chlamydia trachomatis cause ocular disease(trachoma, conjunctivitis) and genital infections (urethritis, epididymitis, cervitis, salpingitis, lymphogranuloma venerum), and infantile pneumonia. During the unique developmental cycle of this obligatory intracellular parasite, the infectious elementary body is transformed into a larger reticulate boby. Definitive diagnosis of Chlamydial infections is usually made by isolation of infectious organisms in cell culture or direct demonstration of specific antigens in inflammatory exutate using monoclonal antibody staining. Both methods, although specific and sensitive, need for special equipments for evaluation of test results and are therefore time consuming and require a trained specialist. Diagnostic detection of specific DNA sequences by nucleic acid hybridization has recently been introduced for several microorganisms. Current knowledge of the chlamydial cryptic plasmid is relatively limited. So we made plasmid probe (pCTDH), and used it to detect C.trachomatis in clinical specimens. C.trachomatis strains of A/HAR-13, B/HAR-36, D/UW-3/Cx, E/Bour, F/IC-Cal-3, G/UW-57/Cx, H/UW-43/Cx, I/UW-12/UR, J/UW-36/UR, K/UW-31/Cx, LGV type 1/440, and LGV type[U/404 were obtained from American Type Culture Collection(ATCC). Strains of serova C, LGV type 11, and C. pneumoniae(TWAR) were obtained from CDC. Control microbial strains were obtaind from routine isolation and identified by standard procedure. The strains included Staphylococcus aureus, staphylococcus epidermidis, gram positive bacilli, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes, Enterobacter cloacae, Acinetobacter lwofjf, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae. Male urethral and female cervical specimen were taken with cotton-tipped swabs into transport medium 2SP, and C.trachomatis were isolated in McCoy cells monolayer. Elementary bodies were purified by differencial centrifugation in 30% renograffin. The plasmid were isolated from C.trachomatis D/Hy1212/Cx by QIA prep-spin kit(QIAGEN, USA) and QIAEX(QIAGEN, USA). BamHI digested plasmid DNA was ligated into BamHI digested dephosphorylated pUC18 and transformed into E.coli(JM83). Colonies expessing AMPr but not /3 -galactosidase were selected and subjected to mini-plasmid analysis. For the hybridization assay, the specimen were treated with proteinase K and boiled in alkaline solution. The lysates were blotted onto Nytran-plus using 96 well Bio-Dot Apparatus(Bio Rad, USA). The Nytrans-plus was air dried and prehybridized for 2h at 65C in 6x SSC supplemented with 5x Denhart's solution and O.lmg salmon sperni DNA ml-1. The plasmid probe(pCTDH) was labelled with [a_32 P by random labelling kit(Baehringer Manheim Biochemical ;Germany), and the Nytran-plus hybridized overnight at 65'C. We found following results. 1. Ctrachomatas (D/HY1212/Cx, and LGV typeII/CDC)had a 7.5Kb plasmid. 2. Recombinant plasmid DNA had cleavage sites by BamHI, XhoI, SmaI, BgllI. 3. The sensitivity of pCTDH was less than 1 pg of whole DNA. 4. The pCTDH reacted with all 15 serovars of Ctrachomatis. 5. No reaction with C. pneumoniae(TWAR) and 10 general microbes were appeared. 6. The pCTDH probe recognized four of 58 specimens, and one of them was culture negative. 54 samples were both negative of culture and pCTDH. 7. The results of PCR were same as the results of pCTDH. In conclusion, we made a very sensitive and specific plasmid probe(pCTDH) for the detection of C.trachomatis from clinical samples.
Keyword
#CHLAMYDIA TRACHOMATIS CRYPTIC PLASMID DNA CLONING 클로닝
학위논문 정보
저자
유정한
학위수여기관
한양대학교 대학원
학위구분
국내박사
학과
의학과
발행연도
1996
총페이지
vi, 27p.
키워드
CHLAMYDIA TRACHOMATIS CRYPTIC PLASMID DNA CLONING 클로닝
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