인삼 모상근을 대량배양하여 유용 2차대사산물을 기내에서 생산하기 위해 인삼의 잎, 줄기, 뿌리절편에 Agrobacterium rhizogenes (strain A₄)를 접종하여 모상근을 유도, 배양한 후 ginsenoside 고생산능 clone을 선발하였다. 여러부위에서 유도된 모상근은 모두 암조건의 MS 배지에서 활발히 생장하였으며, 이들중 HB3 clone을 이용하여 ginsenoside 고 생산성 clone을 선발 한 결과 HB3-10 clone이 최대의 생장을 보였으며 총 ginsenoside 함량은 0.55 wt%로 나타났다. 그러나 총 ginsenoside함량이 가장 높은 clone은 비교적 생장이 느린 HB3-2 clone이었으며 0.74 wt%의 함량을 나타내었다. Dot blot Southern hybridization 결과 Ri plasmid의 T-DNA가 식물체의 genome내로 삽입되어 있었으며, opine 확인 결과 모든 모상근 clone으로부터 agropine과 mannopine이 검출되어 형질전환 조직임을 입증하였다. 모상근 clone들의 세포유전 및 조직학적 특성들을 조사한 결과, 근단세포의 염색체 수는 모든 모상근 clone이 동일한 2n=48을 보유하고 있었다. 또한 HB3 clone중 하나의 세포를 제외하고 모상근에 있어서 염색체의 구조적 변이를 관찰할 수 없었다. 모상근의 단백질 앙상을 알아보기 위하여 SDS-PAGE로 전기영동한 결과 인삼 모근과 모상근은 단백질 양상과 밴드수에 있어서 약간의 차이를 나타내었다. 이들의 조직학적 분석에서도 인삼 모근과 모상근은 다소 차이를 보여 주었으며, 모상근의 경우 유관속계와 피층과의 경계가 뚜렷하고 피층유세포들의 형태와 배열이 불균등하며 세포간극이 매우 크게 발달되어 있었다. 모상근의 최적 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 HB3-10 clone을 여러가지 배양조건에서 배양한 결과, 모상근의 생장은 총 질소원의 농도가 60 mM, 3% sucrose 그리고 0.5 mg/l의 IAA가 첨가된 MS배지(pH 5.5-6.5, 21℃)에서 암배양 하였을때 가장 빠르게 나타났으며, 총 ginsenoside 함량은 호르몬이 없는 위의 조건에서 1000 lux의 빛을 조사하였을 때 가장 높아 암배양의 ginsenoside 함량보다 약 2배 높은 1.12% 수준이었다. 그러나 광조건에서는 모상근의 생장이 암배양보다 낮았으며, 특히 호르몬이 없는 조건에서는 ginsenoside-Rb₁과 -Re의 함량이 크게 증가하고 0.5-1 mg/l의 IAA를 첨가하였을 때는 ginsenoside-Rg₁의 함량이 크게 증가하였다. 인삼 모상근 배양에 의한 anthocyanin의 생산은 HB3-6 clone을 이용하여 빛, 탄소원의 종류, 여러가지 호르몬의 첨가가 모상근의 생장과 수용성 색소인 anthocyanin의 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 배양된 모상근으로부터 색소를 추출, 분리하여 anthocyanin을 동정하였다. 모상근을 광조건에서 배양하면 배양 5일후부터 색소를 합성하였으며 배양 30일에 0.36 mg/g (fr wt)의 색소를 생산하였다. 모상근의 배양시 총질소 농도 60 mM, 탄소원으로 sucrose가 모상근의 생장과 색소의 생산에 적합하였으며, 0.5 mg/l의 IAA를 첨가하였을때 모상근이 가장 빠르게 생장하였고 1 mg/l의 IAA를 첨가하였을때 가장 높은 색소함량(0.41 mg/g fr wt)을 나타내었다. 그러나 2,4-D의 경우 모상근의 생장과 색소합성이 억제되는 경향을 보여주었다. 아울러 anthocyanin 색소를 분리, 동정한 결과 pelargonidin - glucoside로 확인되었다. Air bubble형 생물반응기(3 l)에서 모상근의 대량 배양을 위한 최적 배양 조건을 찾기 위해 배지조성이 모상근의 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향과 모상근 생장 배지의 특성을 조사한 결과, 암조건의 반응기내에서 모상근은 후기 배양단계에 대수적 생장특성을 보여 배양 30일 동안에 처음 무게보다 6.5배 높은 생장을 나타내었다. 그러나 ginsenoside 함량은 총 질소원의 농도가 39.4 mM, 3% sucrose가 첨가된 MS배지(pH 5.5-6.5, 21℃)에서 1000 lux의 빛을 조사하였을 때 가장 높아 1.19%를 나타내었다. 또한 반응기내의 배지성분중 sucrose는 배양 15일까지 glucose와 fructose로 빠르게 환원되어 15일 이후에는 환원당의 농도가 3% 이상을 유지하였고, pH 변화는 배양 5일 이후부터 4.9의 일정한 값을 유지하였다. 따라서 이러한 모든 결과로 부터 선발된 인삼 모상근을 대량배양하여 유용한 2차 대사산물을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
인삼 모상근을 대량배양하여 유용 2차대사산물을 기내에서 생산하기 위해 인삼의 잎, 줄기, 뿌리절편에 Agrobacterium rhizogenes (strain A₄)를 접종하여 모상근을 유도, 배양한 후 ginsenoside 고생산능 clone을 선발하였다. 여러부위에서 유도된 모상근은 모두 암조건의 MS 배지에서 활발히 생장하였으며, 이들중 HB3 clone을 이용하여 ginsenoside 고 생산성 clone을 선발 한 결과 HB3-10 clone이 최대의 생장을 보였으며 총 ginsenoside 함량은 0.55 wt%로 나타났다. 그러나 총 ginsenoside함량이 가장 높은 clone은 비교적 생장이 느린 HB3-2 clone이었으며 0.74 wt%의 함량을 나타내었다. Dot blot Southern hybridization 결과 Ri plasmid의 T-DNA가 식물체의 genome내로 삽입되어 있었으며, opine 확인 결과 모든 모상근 clone으로부터 agropine과 mannopine이 검출되어 형질전환 조직임을 입증하였다. 모상근 clone들의 세포유전 및 조직학적 특성들을 조사한 결과, 근단세포의 염색체 수는 모든 모상근 clone이 동일한 2n=48을 보유하고 있었다. 또한 HB3 clone중 하나의 세포를 제외하고 모상근에 있어서 염색체의 구조적 변이를 관찰할 수 없었다. 모상근의 단백질 앙상을 알아보기 위하여 SDS-PAGE로 전기영동한 결과 인삼 모근과 모상근은 단백질 양상과 밴드수에 있어서 약간의 차이를 나타내었다. 이들의 조직학적 분석에서도 인삼 모근과 모상근은 다소 차이를 보여 주었으며, 모상근의 경우 유관속계와 피층과의 경계가 뚜렷하고 피층유세포들의 형태와 배열이 불균등하며 세포간극이 매우 크게 발달되어 있었다. 모상근의 최적 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 HB3-10 clone을 여러가지 배양조건에서 배양한 결과, 모상근의 생장은 총 질소원의 농도가 60 mM, 3% sucrose 그리고 0.5 mg/l의 IAA가 첨가된 MS배지(pH 5.5-6.5, 21℃)에서 암배양 하였을때 가장 빠르게 나타났으며, 총 ginsenoside 함량은 호르몬이 없는 위의 조건에서 1000 lux의 빛을 조사하였을 때 가장 높아 암배양의 ginsenoside 함량보다 약 2배 높은 1.12% 수준이었다. 그러나 광조건에서는 모상근의 생장이 암배양보다 낮았으며, 특히 호르몬이 없는 조건에서는 ginsenoside-Rb₁과 -Re의 함량이 크게 증가하고 0.5-1 mg/l의 IAA를 첨가하였을 때는 ginsenoside-Rg₁의 함량이 크게 증가하였다. 인삼 모상근 배양에 의한 anthocyanin의 생산은 HB3-6 clone을 이용하여 빛, 탄소원의 종류, 여러가지 호르몬의 첨가가 모상근의 생장과 수용성 색소인 anthocyanin의 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 배양된 모상근으로부터 색소를 추출, 분리하여 anthocyanin을 동정하였다. 모상근을 광조건에서 배양하면 배양 5일후부터 색소를 합성하였으며 배양 30일에 0.36 mg/g (fr wt)의 색소를 생산하였다. 모상근의 배양시 총질소 농도 60 mM, 탄소원으로 sucrose가 모상근의 생장과 색소의 생산에 적합하였으며, 0.5 mg/l의 IAA를 첨가하였을때 모상근이 가장 빠르게 생장하였고 1 mg/l의 IAA를 첨가하였을때 가장 높은 색소함량(0.41 mg/g fr wt)을 나타내었다. 그러나 2,4-D의 경우 모상근의 생장과 색소합성이 억제되는 경향을 보여주었다. 아울러 anthocyanin 색소를 분리, 동정한 결과 pelargonidin - glucoside로 확인되었다. Air bubble형 생물반응기(3 l)에서 모상근의 대량 배양을 위한 최적 배양 조건을 찾기 위해 배지조성이 모상근의 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향과 모상근 생장 배지의 특성을 조사한 결과, 암조건의 반응기내에서 모상근은 후기 배양단계에 대수적 생장특성을 보여 배양 30일 동안에 처음 무게보다 6.5배 높은 생장을 나타내었다. 그러나 ginsenoside 함량은 총 질소원의 농도가 39.4 mM, 3% sucrose가 첨가된 MS배지(pH 5.5-6.5, 21℃)에서 1000 lux의 빛을 조사하였을 때 가장 높아 1.19%를 나타내었다. 또한 반응기내의 배지성분중 sucrose는 배양 15일까지 glucose와 fructose로 빠르게 환원되어 15일 이후에는 환원당의 농도가 3% 이상을 유지하였고, pH 변화는 배양 5일 이후부터 4.9의 일정한 값을 유지하였다. 따라서 이러한 모든 결과로 부터 선발된 인삼 모상근을 대량배양하여 유용한 2차 대사산물을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
Leaf, stem, and root segments of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) formed hairy roots when cocultured with Agrobacterium rhizogenes strain A₄. Of hairy roots maintained in MS medium in the dark, four root clones were selected on the basis of their faster growth rate or higher ginsenoside con...
Leaf, stem, and root segments of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) formed hairy roots when cocultured with Agrobacterium rhizogenes strain A₄. Of hairy roots maintained in MS medium in the dark, four root clones were selected on the basis of their faster growth rate or higher ginsenoside content. A clone designated to HB3-10 clone showed the highest growth rate, but produced a total ginsenoside of 0.55 wt%. The HB3-2 clone had the lowest growth rate with the highest productivity of total ginsenoside, 0.74 wt% Dot blot Southern hybridization revealed that T-DNA of A. rhizogenes Ri-plasmid was incorporated to the plant genome. A paper electrophoresis detected agropine and mannopine in extracts of the clones. These results confirmed that the clones were transformed. All of the clones had the normal diploid number of chromosomes (2n=48). Of the HB3 clones, no variation in chromosomal structure was observed except for one cell. When the extracted total protein of clones was run by SDS-PAGE, they were different from that of intact (nontransformed) ginseng root in the pattern and number of bands on the gel. The hairy root had a clearly defined vascular strand and disorganized cortical cells with large intercellular spaces. To determine the conditions for the optimum growth and high ginsenoside content in hairy root cultures, the HB3-10 clone was cultured in various culture conditions. The maximum growth of hairy roots was shown when it was cultured in MS medium (pH 5.5-6.5, 21℃) containing 3% sucrose, total 60 mM nitrogen source, and 0.5 mg/l IAA under the dark condition. However, the highest ginsenoside content of hairy roots was obtained with cultures in the 16 h cool -white light (1000 lux) photoperiodic condition, and the ginsenoside content of hairy roots cultured in this light condition was about twice (1.12 wt%) than in the dark condition although it showed a lower growth rate in the dark. In the hairy root cultures under the light condition, the content of ginsenoside-Re and -Rb₁was specifically increased. In addition, the content of ginsenoside-Rg₁was also increased when cultured in medium containing 0.5-1 mg/l IAA in the same culture condition. The effects of light, carbon source and various growth regulators on the growth and anthocyanin production were investigated for the HB3-6 clone. Anthocyanin synthesis was detected after 5 days of the exposure to the light. and a maximum yield of anthocyanin reached 0.36 mg/g (fr wt) in MS medium after 30 days. The concentrations of total 60 mM nitrogen source, and 3% sucrose as a carbon source enhanced the growth and anthocyanin production of the clone. Supplement of 0.5 mg/l IAA to MS medium was the most suitable for the hairy roots growth. The highest accumulation of anthocyanin (0.41 mg/g, fr wt) was obtained when it was cultured in medium with 1 mg/l IAA, whereas addition of 2,4-D restrained the pigment synthesis. The main anthocyanin in ginseng hairy roots was identified as pelargonidin - glucoside. To find out the optimum conditions for hairy root cultures in a bioreactor with air bubbles, the effects of medium components including growth regulators on the growth and ginsenoside content of hairy roots (HB3-10 clone), and the characteristics of growth medium were analyaed. When hairy roots were cultured in a 3 ℓbioreactor with air bubbles, the hairy roots showed an exponential growth during the later growth stage and the final cell mass was 6.5-fold higher than the initial cell mass in the dark condition after 30 days of culture. The optimum ginsenoside content of hairy roots was obtained from MS medium containing total 39.4 mM nitrogen source without growth regulators in the light condition, wherein the total ginsenoside content was 1.19 wt%. Sucrose concentration decreased almost proportional to the concentrations of glucose and fructose. The medium pH was dropped from 5.5 to 4.9 after 5 days, but it remained stable afterwards. The overall results suggest that the selected ginseng hairy roots are producing useful ginsenosides in a bioreactor probably on a commercial scale.
Leaf, stem, and root segments of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) formed hairy roots when cocultured with Agrobacterium rhizogenes strain A₄. Of hairy roots maintained in MS medium in the dark, four root clones were selected on the basis of their faster growth rate or higher ginsenoside content. A clone designated to HB3-10 clone showed the highest growth rate, but produced a total ginsenoside of 0.55 wt%. The HB3-2 clone had the lowest growth rate with the highest productivity of total ginsenoside, 0.74 wt% Dot blot Southern hybridization revealed that T-DNA of A. rhizogenes Ri-plasmid was incorporated to the plant genome. A paper electrophoresis detected agropine and mannopine in extracts of the clones. These results confirmed that the clones were transformed. All of the clones had the normal diploid number of chromosomes (2n=48). Of the HB3 clones, no variation in chromosomal structure was observed except for one cell. When the extracted total protein of clones was run by SDS-PAGE, they were different from that of intact (nontransformed) ginseng root in the pattern and number of bands on the gel. The hairy root had a clearly defined vascular strand and disorganized cortical cells with large intercellular spaces. To determine the conditions for the optimum growth and high ginsenoside content in hairy root cultures, the HB3-10 clone was cultured in various culture conditions. The maximum growth of hairy roots was shown when it was cultured in MS medium (pH 5.5-6.5, 21℃) containing 3% sucrose, total 60 mM nitrogen source, and 0.5 mg/l IAA under the dark condition. However, the highest ginsenoside content of hairy roots was obtained with cultures in the 16 h cool -white light (1000 lux) photoperiodic condition, and the ginsenoside content of hairy roots cultured in this light condition was about twice (1.12 wt%) than in the dark condition although it showed a lower growth rate in the dark. In the hairy root cultures under the light condition, the content of ginsenoside-Re and -Rb₁was specifically increased. In addition, the content of ginsenoside-Rg₁was also increased when cultured in medium containing 0.5-1 mg/l IAA in the same culture condition. The effects of light, carbon source and various growth regulators on the growth and anthocyanin production were investigated for the HB3-6 clone. Anthocyanin synthesis was detected after 5 days of the exposure to the light. and a maximum yield of anthocyanin reached 0.36 mg/g (fr wt) in MS medium after 30 days. The concentrations of total 60 mM nitrogen source, and 3% sucrose as a carbon source enhanced the growth and anthocyanin production of the clone. Supplement of 0.5 mg/l IAA to MS medium was the most suitable for the hairy roots growth. The highest accumulation of anthocyanin (0.41 mg/g, fr wt) was obtained when it was cultured in medium with 1 mg/l IAA, whereas addition of 2,4-D restrained the pigment synthesis. The main anthocyanin in ginseng hairy roots was identified as pelargonidin - glucoside. To find out the optimum conditions for hairy root cultures in a bioreactor with air bubbles, the effects of medium components including growth regulators on the growth and ginsenoside content of hairy roots (HB3-10 clone), and the characteristics of growth medium were analyaed. When hairy roots were cultured in a 3 ℓbioreactor with air bubbles, the hairy roots showed an exponential growth during the later growth stage and the final cell mass was 6.5-fold higher than the initial cell mass in the dark condition after 30 days of culture. The optimum ginsenoside content of hairy roots was obtained from MS medium containing total 39.4 mM nitrogen source without growth regulators in the light condition, wherein the total ginsenoside content was 1.19 wt%. Sucrose concentration decreased almost proportional to the concentrations of glucose and fructose. The medium pH was dropped from 5.5 to 4.9 after 5 days, but it remained stable afterwards. The overall results suggest that the selected ginseng hairy roots are producing useful ginsenosides in a bioreactor probably on a commercial scale.
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