B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 항체 발현 및 생산과 그 항체를 이용한 Time-Resolved Fluoroimmunoassay법의 개발 Expression and Purification of the Antibodies against the Hepatitis B Virus Surface Antigen and Its Application for the Development of Time-Resolved Fluoroimmunoassay원문보기
B형 간염바이러스(HBV)에 특이성을 갖는 항체들이 세포융합과 항체 engineering기법에 의해 생산되었으며, 이들을 이용하여 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정을 위한 time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA)법이 개발되었다. 1. HBV prS1 항원에 대한 단일클론항체를 생산하기위해 maltose-binding ...
B형 간염바이러스(HBV)에 특이성을 갖는 항체들이 세포융합과 항체 engineering기법에 의해 생산되었으며, 이들을 이용하여 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정을 위한 time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA)법이 개발되었다. 1. HBV prS1 항원에 대한 단일클론항체를 생산하기위해 maltose-binding protein (MBP)-preS1(56)과 glutathione S-transferase(GST)-preS가 E. coli에서 수용성 형태로 발현되어 세포 lysate로 부터 정제되었다. 2. 각 융합단백질은 Balb/C 생쥐에 면역화 되었고, 그 결과 6개의 단일 크론 항체가 얻어졌으며, 이들 중 1B3와 7H8의 항원 epitope을 조사한 결과, 각각 preSl의 N-말단 1-2Oaa와 42-49aa를 인식하는 것으로 나타났다. 3. Single-chain immunoglobulin(ScIg)를 생산하기 위해 단일클론항체의 heavy chain variable영역은 linker에 의해 light chain variable 영역의 아미노말단과 공유결합에 의해 연결되었으며, C-말단을 γ1 constant의 hinge 영역에 융합시켰다. 4. 이것은 Chinese hamster ovary세포에서 dihydrofolate reductase 증폭과정에 의해 발현되었다. 항체를 안정적으로 발현하는 2E11 세포주가 선별되어 Protein G-sepharose에 의한 친화성 크로마토그래피로 세포 상층액으로 부터 정제되었다. 5. 2E11 항체의 항원결합 친화력은 ScIg의 모 항체인 chimeric 항체 CS131A 의 1/2 정도였다. 2E11과 CS131A의 PBS와 인간혈청에서의 열안 정성조사에서 2E11의 안정성과 활성이 PBS에서 보다 혈청에서 더 우수 한 것으로 나타났으며, 생리학적 온도에서는 CS131A와 거의 대등한 안정성을 나타냈다. 6. TR-FIA 개발을 위해 1B3와 ScIg을 europium chelate로 표지시켜 labelling yield를 조사한 결과, HBs 항원, lB3항체, 그리고 ScIg의 yield가 각각 0.98, 5.55, 3.36으로 나타났다. TR-FIA에 의한 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정 감도는 2ng/well이었으며,. ELISA와의 상관관계는 각각 y=-76864.7+67553.9x(r=0.92)와 =-15.1+38.9x(r=0.94)로 나타났다. 7. ScIg와 IB3의 two-site sandwich법에 의한 TR-FIA에 의해 HBs 항원이 양성인 환자의 혈청에서 감염성 particle을 조사하였다. 그 결과 감염성 particle과 HBs항원 농도간에 서로 상관관계를 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는 ScIg와 anti-preSl 단일클론항체가 성공적으로 발현, 생산되었으며, 이들 항체를 이용한 HBs 항원과 anti-HBs 항체측정을 위한 TR-FIA는 RIA를 대치할 수 있는 안정된 높은 감도의 assay법인 것을 지적한다.
B형 간염바이러스(HBV)에 특이성을 갖는 항체들이 세포융합과 항체 engineering기법에 의해 생산되었으며, 이들을 이용하여 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정을 위한 time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA)법이 개발되었다. 1. HBV prS1 항원에 대한 단일클론항체를 생산하기위해 maltose-binding protein (MBP)-preS1(56)과 glutathione S-transferase(GST)-preS가 E. coli에서 수용성 형태로 발현되어 세포 lysate로 부터 정제되었다. 2. 각 융합단백질은 Balb/C 생쥐에 면역화 되었고, 그 결과 6개의 단일 크론 항체가 얻어졌으며, 이들 중 1B3와 7H8의 항원 epitope을 조사한 결과, 각각 preSl의 N-말단 1-2Oaa와 42-49aa를 인식하는 것으로 나타났다. 3. Single-chain immunoglobulin(ScIg)를 생산하기 위해 단일클론항체의 heavy chain variable영역은 linker에 의해 light chain variable 영역의 아미노말단과 공유결합에 의해 연결되었으며, C-말단을 γ1 constant의 hinge 영역에 융합시켰다. 4. 이것은 Chinese hamster ovary세포에서 dihydrofolate reductase 증폭과정에 의해 발현되었다. 항체를 안정적으로 발현하는 2E11 세포주가 선별되어 Protein G-sepharose에 의한 친화성 크로마토그래피로 세포 상층액으로 부터 정제되었다. 5. 2E11 항체의 항원결합 친화력은 ScIg의 모 항체인 chimeric 항체 CS131A 의 1/2 정도였다. 2E11과 CS131A의 PBS와 인간혈청에서의 열안 정성조사에서 2E11의 안정성과 활성이 PBS에서 보다 혈청에서 더 우수 한 것으로 나타났으며, 생리학적 온도에서는 CS131A와 거의 대등한 안정성을 나타냈다. 6. TR-FIA 개발을 위해 1B3와 ScIg을 europium chelate로 표지시켜 labelling yield를 조사한 결과, HBs 항원, lB3항체, 그리고 ScIg의 yield가 각각 0.98, 5.55, 3.36으로 나타났다. TR-FIA에 의한 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정 감도는 2ng/well이었으며,. ELISA와의 상관관계는 각각 y=-76864.7+67553.9x(r=0.92)와 =-15.1+38.9x(r=0.94)로 나타났다. 7. ScIg와 IB3의 two-site sandwich법에 의한 TR-FIA에 의해 HBs 항원이 양성인 환자의 혈청에서 감염성 particle을 조사하였다. 그 결과 감염성 particle과 HBs항원 농도간에 서로 상관관계를 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는 ScIg와 anti-preSl 단일클론항체가 성공적으로 발현, 생산되었으며, 이들 항체를 이용한 HBs 항원과 anti-HBs 항체측정을 위한 TR-FIA는 RIA를 대치할 수 있는 안정된 높은 감도의 assay법인 것을 지적한다.
We attempted to generate single-chain antibodies(Sclg) against the hepatitis B virus surface antigen(HBsAg) and to apply the antibodies for developing a time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) system. 1. Hepatitis B virus(HBV) preSl proteins fused with the maltose binding protein (MBP)-preSl(56) or ...
We attempted to generate single-chain antibodies(Sclg) against the hepatitis B virus surface antigen(HBsAg) and to apply the antibodies for developing a time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) system. 1. Hepatitis B virus(HBV) preSl proteins fused with the maltose binding protein (MBP)-preSl(56) or the glutathione S-transferase (GST)-preS were expressed in E. coli and purified from the cell lysate. Each fusion proteins were immunized into Balb/C mice. 2. Six clones secreting a good amount of the mAb were isolated and characterized. Among them, the 1B3 and the 7H8 antibody recognized N-terminal 1-20aa and 42-49aa of the preS1 sequence, respectively. 3. We tried to create a ScIg maintaining the same specificity with the conventional mAb against the HBsAg. The heavy chain variable domains of the antibody was covalently joined to N-terminus of the light chain variable domain via synthetic linker The C-terminus of the light chain was then connected to the γ1 constant region by the hinge region. 4. The construct was then recombined with the expression vector pSGIG-S and expressed in Chinese hamster ovary cells using a procedure for dihydrofolate reductase amplification. 5. A clone (2E11) was selected and produced antibodies were purified from the culture supernatant by a Protein G affinity column. Antigen-binding affinity of the 2E11 was half of the parental chimeric antibody CS131A. 6. To develop a TR-FIA system, HBsAgs or ScIgs were conjugated with the europium chelate. This assay system was able to detect the HBsAg or the anti-HBs Ab at the level of 2ng/well, and showed a linear regression equation of y=-76864.7+67553.9x(r=0.92) or y=-15.1+38.9x(r=0.94) when compared with the measurements of 22 samples performed by a conventional ELISA method. 7. To further confirm practicality of the system, the patient sera were analyzed by TR-FIA based on two-site sandwich method of ScIg and anti-preS1 mAb (1B3). The concentration of infectious particle and HBsAg were shown to be well correlated with each other. These results indicated that the ScIg and the anti-preSl mAb were sucessfully generated, and the TR-FIA made of these antibodies was able to measure HBsAg or anti-HBsAb in a stable and sensitive manner.
We attempted to generate single-chain antibodies(Sclg) against the hepatitis B virus surface antigen(HBsAg) and to apply the antibodies for developing a time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) system. 1. Hepatitis B virus(HBV) preSl proteins fused with the maltose binding protein (MBP)-preSl(56) or the glutathione S-transferase (GST)-preS were expressed in E. coli and purified from the cell lysate. Each fusion proteins were immunized into Balb/C mice. 2. Six clones secreting a good amount of the mAb were isolated and characterized. Among them, the 1B3 and the 7H8 antibody recognized N-terminal 1-20aa and 42-49aa of the preS1 sequence, respectively. 3. We tried to create a ScIg maintaining the same specificity with the conventional mAb against the HBsAg. The heavy chain variable domains of the antibody was covalently joined to N-terminus of the light chain variable domain via synthetic linker The C-terminus of the light chain was then connected to the γ1 constant region by the hinge region. 4. The construct was then recombined with the expression vector pSGIG-S and expressed in Chinese hamster ovary cells using a procedure for dihydrofolate reductase amplification. 5. A clone (2E11) was selected and produced antibodies were purified from the culture supernatant by a Protein G affinity column. Antigen-binding affinity of the 2E11 was half of the parental chimeric antibody CS131A. 6. To develop a TR-FIA system, HBsAgs or ScIgs were conjugated with the europium chelate. This assay system was able to detect the HBsAg or the anti-HBs Ab at the level of 2ng/well, and showed a linear regression equation of y=-76864.7+67553.9x(r=0.92) or y=-15.1+38.9x(r=0.94) when compared with the measurements of 22 samples performed by a conventional ELISA method. 7. To further confirm practicality of the system, the patient sera were analyzed by TR-FIA based on two-site sandwich method of ScIg and anti-preS1 mAb (1B3). The concentration of infectious particle and HBsAg were shown to be well correlated with each other. These results indicated that the ScIg and the anti-preSl mAb were sucessfully generated, and the TR-FIA made of these antibodies was able to measure HBsAg or anti-HBsAb in a stable and sensitive manner.
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