초록 ▼

B형 간염바이러스는 인체에 감염하여 급성 혹은 만성 간염을 유발하며, 만성간염의 경우 20-30%가 간경변이나 간암으로 진전된다. 본 연구실은 HBV의 복제, 증식에 대한 정보를 제공함과 동시에 간염 치료제 및 예방 백신 개발에 기여하고자 HBV core 단백질의 세포 내 이동과 숙주 단백질과의 상호작용에 대한 연구를 수행하였다.
(1) Core 단백질의 발현과 세포 내 이동 기작.
Core 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역염색 (Immunofluorescence assay)을 수행한 결과 핵, 세포질 또는

B형 간염바이러스는 인체에 감염하여 급성 혹은 만성 간염을 유발하며, 만성간염의 경우 20-30%가 간경변이나 간암으로 진전된다. 본 연구실은 HBV의 복제, 증식에 대한 정보를 제공함과 동시에 간염 치료제 및 예방 백신 개발에 기여하고자 HBV core 단백질의 세포 내 이동과 숙주 단백질과의 상호작용에 대한 연구를 수행하였다.
(1) Core 단백질의 발현과 세포 내 이동 기작.
Core 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역염색 (Immunofluorescence assay)을 수행한 결과 핵, 세포질 또는 핵과 세포질에 모두 위치하는 경향을 보였다. 이 단백질의 위치이동 기작을 규명하고자 보다 자세히 분석한 결과, core 단백질의 C 말단쪽 절반(coreC)에는 핵 이동신호가 존재함에도 불구하고 핵 외부에 응집되어 있는 형태를 나타내었다. mitochondria로 targeting되는 RFP (red fluorescence protein)를 발현하는 벡터와 cotransfection한 결과 coreC는 mitochondria로 위치함을 확인할 수 있었다. 따라서 core 단백질의 세포 내 이동엔 보다 복잡한 조절작용이 있음을 시사 하였다.
(2) Core 단백질의 세포 내 기능 및 타 단백질과의 상호작용.
- HBx 단백질에 대한 영향.
간암의 원인들 중 하나로 추정되는 HBV X 단백질과 cotransfection을 했을 때 core 단백질이 X의 발현을 억제하는 흥미 있는 실험결과를 얻었고 이에 기초하여 두 단백질간의 상호작용에 관여하는 기작을 연구한 결과 이들 사이엔 proteasome-mediated degradation이 관여함을 확인할 수 있었다. X 단백질의 proteasomal degradation엔 특히 core 단백질의 C쪽 절반에 해당하는 부분이 관여하고, core 단백질의 이러한 효과는 X 단백질에 특이적으로 일어나는 현상임을 밝혔다.
- Core 단백질과 상호작용이 있는 숙주세포 단백질 탐색.
Yeast-two hybrid를 통해 core 단백질과 결합하는 11개의 숙주 세포 단백질을 찾아낼 수 있었는데, 이들 중 DnaJB1과 Tid-1이 간 세포주에서 core 단백질과 결합하고, 특히 hTid-1은 core단백질의 C쪽 말단에 해당하는 단백질과 핵 외부에 colocalize함을 확인할 수 있었다. hTid-1은 mitochondria에 위치하는 것으로 밝혀진 human DnaJ 단백질로, HPV의 E7 단백질, HTLV-1의 tax 단백질 등과 상호작용함이 확인된 바 있다. 이 단백질은 세포사멸과 인터페론 신호전달경로에 관여하는 것으로 밝혀졌는데, core단백질과 hTid-1 단백질의 상호작용을 연구함으로써 core 단백질이 숙주세포에 영향을 미치는 기전을 밝히는데 도움이 될 것으로 생각된다.

Abstract ▼

Hepatitis B virus (HBV) is closely associated with acute or chronic hepatitis as well as the development of hepatocellular carcinoma (HCC). To understand the role of core protein in the replication and pathogenesis of KBV, we have analyzed the subcellular localization of core protein and its roles i

Hepatitis B virus (HBV) is closely associated with acute or chronic hepatitis as well as the development of hepatocellular carcinoma (HCC). To understand the role of core protein in the replication and pathogenesis of KBV, we have analyzed the subcellular localization of core protein and its roles in HBV and host cell. Our findings will contribute to the development of anti-viral drugs and vaccines.
1. Subcellular localization of core protein.
The core protein localized to the nuclei or the cytoplasm, or both, of core expression vector transfected hepatoma cells. Although core protein has nuclear localizing signal (NLS) in the C terminal domain, core protein t-terminal half (coreC) localized to the cytoplasm with punctated pattern. This pattern has shown in mitochondria targeting proteins. The mitochondrial localization of coreC was confirmed using mitochondria targeting REP (red fluorescence protein).
2. The biological function of core protein in the HBV and host cell.
(1) Stimulation of HBx degradation by core protein.
The HBx plays an essential role in viral replication and development of hepatocellular carcinoma. HBx has the capability to transactivate expression of all HBV proteins including the viral core protein. We observed that the level of HBx was significantly reduced by co-expression of core protein in cultured human hepatoma cells, whereas the level of HBx mRNA was not affected. The repression of HBx by core was relieved by treatment of the cells with proteasome inhibitor MG132, indicating that the effect is through stimulation of proteasome-mediated degradation of HBx. The inhibitory effect of HBx was specific to HBx. Although a direct physical interaction between core and HBx could not be demonstrated, mutational analysis indicated that the C-terminal half of the core is responsible for the inhibitory effect. These results suggest that core functions as a novel regulator of HBV life cycle and hepatocellular carcinogenesis through the control of HBx level in a feedback-type inhibition.
(2) Identification of cellular proteins that interact with core protein.
In order to identify cellular proteins that interact with HBV core protein, we screened a for hTid-1 protein, a human homolog of the Drosophila tumor suppressor protein Tid56. And another clone was represented Hdj1, a member of Hsp40 protein family. The interaction of coreC and hTid-1 or Hdj1 were confirmed by in vivo binding assay. CoreC-HA and hTid1-V5/His or Hdj1-VS/His constructs were transiently cotransfected into Huh7 cells and overexpressed using vTF7-3. The lysates were incubated with TALON resin and immunoblotted with anti-HA antibody. Based on the observation that coreC and hTid-1 interact with each other in vitro and in vivo, cellular localization was investigated by indirect double immunofluorescence assay. For this study, Huh7 cells were transiently transfected with coreC-HA and ,hTid1-V5/His constructs and analyzed by fluorescence microscope. Overlaying of two images indicates that coreC and hTid-1 colocalize in the cytoplasm with punctated pattern in transfected Huh7 cells. hTid-1 reported that interacts with HPV E7 protein and HTLV Tax protein and functions in the apoptosis, interferone signaling and NF-kB activity, The results suggest that the interaction of core and hTid-1 plays a role in HBV replication and pathogenesis.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...33
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성...38
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...41
• 6. 첨부서류...42