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본 연구는 강력한 살충력을 갖는 생물살충제의 개발을 위해 생물살충제의 관점에서 AcNPV가 갖는 단점인 너무 늦게 발현된다는 것을 독성의 강화로 극복하고, 원핵세포의 유전자가 진핵체계에서 효과적으로 발현할 수 있는가를 알아보기 위하여 수행되었다. 실험에 사용된 인시목에 제일 강력한 독성을 갖는 B. thuringiensis var. kurstaki HD - 1의 천체 플라스미드 DNA로부터 ...

본 연구는 강력한 살충력을 갖는 생물살충제의 개발을 위해 생물살충제의 관점에서 AcNPV가 갖는 단점인 너무 늦게 발현된다는 것을 독성의 강화로 극복하고, 원핵세포의 유전자가 진핵체계에서 효과적으로 발현할 수 있는가를 알아보기 위하여 수행되었다. 실험에 사용된 인시목에 제일 강력한 독성을 갖는 B. thuringiensis var. kurstaki HD - 1의 천체 플라스미드 DNA로부터 ICP 유전자를 클로닝하여 A. californica nuclear polyhedrosis virus로의 제조합 실험들을 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. B. thuringiensis var. kurstaki HD - 1의 ICP 유전자는 73kd 플라스미드 상에 존재하며, BamHI 14kb 단편 중에서도 NdeI 3.8kb 단편에 존재한다. 2. Bt의 ICP 유전자를 NdeI 3.8kb DNA 단편으로 pBluescript SK(+) phagemid vector에 클로닝하여 얻은 클론을 pHLN1 - 80과 pHLN2 - 80이라 명명하였다. 3. pHLN1 - 80과 pHLN2 - 80은 E. coli XL1 - blue 내에서 효과적으로 발현되며 Bombyx mori를 치사시키기에 충분한 양의 ICP를 생산하고 있었다. 특히, pHLN2 - 80은 불완전한 자체 프러모터에도 불구하고 다향의 ICP를 생산하고 있었다. 4. pHLN1 - 80을 주형으로 번역개시 ATG 코돈 앞의 불필요한 -80bp를 제거하고, 약 70Kb의 활성 ICP를 생산하는 1.9kb 유전자만을 클로닝하기 위하여 PCR을 실시하여 pHLR과 pHLRF를 만들었다. 이것을 다시 3.8kb 전체 ICP 유전자를 갖는 클론으로 재구성하여 pHLRS와 pHLRFS라 명명하였다. 5. pHLRF와 pHLRFS는 E. coli 내에서, 벡터의 β - galactosidase promoter에 의해 융합 단백질의 형태로 ICP를 생산해냈다. 6. pHLR과 pHLRS 클론으로부터 각각 1.9kb와 3.8kb ICP 유전자를 추출하여 AcNPV에 대한 cotranafection vector인 pBacPAK9에 클로닝하여 각각을 pBacBT1.9와 pBacBT3.8이라 명명하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

The insecticidal protein(ICP) gene from the total plasmids of Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD -1(Bt) was cloned and recombinated into the baculovirus. In the first, the total plasmids were digested with NdeⅠand 3.8kb fragments were purified from agarose gel. The NdeⅠ 3.8kb fragments that the...

The insecticidal protein(ICP) gene from the total plasmids of Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD -1(Bt) was cloned and recombinated into the baculovirus. In the first, the total plasmids were digested with NdeⅠand 3.8kb fragments were purified from agarose gel. The NdeⅠ 3.8kb fragments that the ends were repaired with Klenow DNA polymerase were inserted into the SmaⅠsite of pBluescript SK(+) phagemid vectors to generate pHLN1 - 80 and pHLN2 - 80. The pHLN1 - 80 contains ICP gene placed under the control of β - galactosidase procoter of phagemid vectors and - 80bp upstream from ATG translational start codon. Another clone, pHLN2 - 80 contains the ICP gene of reverse orientation Analysis of SDS - PAGE and Western blot showed that the ICP was expressed in E. coli. The pHLN2 - 80 especially, over - expressed ICP and exhibited more powerful toxicity than pHLN1 - 80. There were no restriction sites near the 5' end and half of the ICP gene suitable for cloning the active ICP gene(about 1.9kb) into pBacPAK9 under control of the polyhedrin promoter. Therefore, in the second, the ICP gene of pHLN1 - 80 was modified and reconstructed using PCR to create one restriction site and translation stop codon. By PCR, pHLR and pHLRF were constructed, and pHLRS and pHLRFS were reconstructed with pBluescript SK(+) to create the clones containing full - length and truncated ICP gene, but deleting available -80bp of pHLN1 -80. Full - length and truncated ICP gene were expressed in E. coli under control of the β - galactosidase promoter. In the third, full - length and truncated ICP gene were cloned into pBacPAK9, AcNPV cotransfer vector, and named pBacBT3.8 and pBacBT1.9. The genes were inserted into the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV) by recombination in Spodoptera frugiperda(Sf) Bsu36Ⅰ. Putative recombinant AcNPVs carrying the full - length and truncated ICP genes were selected and named vAcICP130 and vAcICP70. Infection of Sf cells with plaque - purified putative recombinant virus, expressing either the full - length of truncated ICP was performed. These results demonstrate the possability of prokaryotic gene expression in eurokaryotic system and the utility of the improved baculovirus system for biological insecticides.

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