위암은 국내 암발생율의 50 % 정도를 차지하고 있어 발생율이 매우 높은 뿐만 아니라 1960년대 이후 현재까지 그 발생율이 점차 증가추세에 있다. 그러나 서양권에서는 발생율이 매우 희박하여 전세계적으로 다른 암종에 비하여 위암의 발달 및 진행에 대한 연구는 거의 전무하다 볼 수 있다. 따라서 위암의 발달 및 진행과정을 이해하는 것이 요구되어 본 연구에서는 암억제유전자 및 암유전자의 유전적 변이를 위암 ...
위암은 국내 암발생율의 50 % 정도를 차지하고 있어 발생율이 매우 높은 뿐만 아니라 1960년대 이후 현재까지 그 발생율이 점차 증가추세에 있다. 그러나 서양권에서는 발생율이 매우 희박하여 전세계적으로 다른 암종에 비하여 위암의 발달 및 진행에 대한 연구는 거의 전무하다 볼 수 있다. 따라서 위암의 발달 및 진행과정을 이해하는 것이 요구되어 본 연구에서는 암억제유전자 및 암유전자의 유전적 변이를 위암 세포주 및 위암조직에서 관찰하였으며, 이들 유전자들의 상관관계 및 생리학적 기전을 이해함으로써 위암의 진행과정을 분자생물학적 측면에서 이해하고자 하였다. 암억제유전자중 가장 잘 알려진 p53의 유전적 변이를 조사하기 위하여 PCR-SSCP와 면역조직화학법을 실행한 결과, 위암 세포주 SNU-16, SNU-5, MKN-45, Kato-Ⅲ 모두에서 mutation이 관찰되었으며, 25 예의 위암환자 암조직 중 12 예에서 mutation이 관찰되어 매우 높은 비율(48%)의 유전적 변이가 관찰되었다. 위암조직에서 p53의 유전적 변이는 병리학적 tumor stage와 상관없이 양성종양(adenoma) 및 악성종양 (adenocarcinoma)모두에서 높은 비율로 관찰되어 p53의 유전적 변이는 위암의 발달 및 진행의 초기에 일어날 수 있으며, 악성으로 진행시키는데 있어서도 p53의 유전적 변이가 중요한 역할을 할 것으로 판단되었디. 따라서 위암의 발생 및 악성으로의 진행에 있어 p53의 유전적 변이는 필수 적임을 알 수 있었다. p53에 의해 발현이 조절되는 cyclin dependent kinase의 저해제인 WAF-1/CIP-1/p21 유전자의 mRNA발현은 암조직, 전이 암조직 및 정상 위점막조직에서 p53의 mutation 여부와는 상관없이 일정하였다. 따라서 WAF-1의 발현의 감소는 위암에서 관찰되지 않아 위암의 진행에 있어서 큰 영향을 미치지 않으며, p53에 의해서만 발현이 증가되는 것이 아니라 alternative pathway에 의해서도 발현의 증가가 이루어질 수 있음을 시사하였다. 또 다른 암억제인자인 Rb, MTS-1 유전자는 4 위암 세포주에서 유전적 변이가 관찰되지 않아 위암의 진행에 중요하지 않을 것으로 판단되었다. 암유전자의 대표적인 예인 c-myc 유전자는 발현의 증가에 의해 암을 유발한다고 알려져 있다. 위암환자조직으로부터 RNA를 추출하여 Nothern bloting으로 c-myc mRNA level을 조사한 결과, c-myc 유전자의 과대발현이 24% (9/37)에서 관찰되었다. 이러한 과대발현이 DNA level에서의 증폭때문인지를 확인하기 위하여 Southern blotting을 실행한결과 DNA level에서의 증폭은 17% (3/18)가 관찰되어 위암에서 c-myc 의 과대발현은 DNA level에서 증폭때문인 경우가 33% (3/9)를 차지하였다. bfl-1은 포항공대와 원자력병원의 공동연구에 의해 최초로 발표된 유전자로서 apoptosis를 조절하는 bcl-2 계 유전자의 하나로 Al 유전자와 72%의 sequence-homology를 가져 Al 유전자와 마찬가지로 apoptosis를 저해할 것으로 판단되었다. 위암조직에서 mRNA의 발현을 조사한 결과 정상 위점막조직에서는 발현이 관찰되지 않은 반면, 종양조직 및 림프절전이 종양조직에서 86% (25/29)의 증가된 mRNA 발현이 있었으며 위암 세포주 및 양성종양에서는 bfl-1의 발현은 관찰되지 않았다. bfl-1의 발현정도와 암의 stage와의 통계학적인 관계를 조사한 결과 암의 stage가 낮을수록 bfl-1의 발현이 높은 비율로 증가되었다(p=0.035). 이러한 결과로 위암의 진행에 있어서 bfl-1 발현의 증가는 양성종양에서 초기 약성종양으로 진행하는데 필수적임을 알 수 있었으며, bfl-1의 생리학적 기능은 bcl-2와 마찬가지로 apoptosis를 저해하는 유전자일 것으로 예측되었다. 상피조직의 주된 growth factor인 transforming growth factor(TGF-α)와 이의 receptor인 epidermal growth factor receptor(EGFR) 및 EGFR의 활성화된 형태인 c-erb B_(2) mRNA의 발현을 위압조직에서 관찰하였다. TGF-α 및 EGF receptor는 12.5% (1/8)의 mRNA 발현증대가 있었으며 mRNA의 발현증대가 있는 예는 일치하지 않아 autocrine loop 은 관찰되지 않았다. c-erb-B_(2) mRNA 발현증대는 EGF receptor보다는 높은 비율인 25% (5/20)가 관찰되었다(Figure 1.17, 18), 상기와 같은 결과로 볼 때 thyroid, lung의 암에서 EGF receptor-TGF-α autocrine loop 이 암의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다 하더라도 진행성 위암에서는 관련성이 적은 것으로 보여진다. c-erb-B_(2) mRNA가 5 예에서 발현증대가 보이는 것으로 보아 위암의 진행에 있어서 c-erd-B_(2)는 중요한 역할을 할 것으로 사료되었다. Cyclin B_(2) homologue는 포항공대에서 최초로 cloning한 유전자로서 mouse로부터 얻어진 human cyclin B_(2)와 현저한 sequence homology를 보여 cyclin B_(2)와 같이 cell cycle stimulator로 작용할 것으로 사료되어 위암에서 mRNA의 발현을 조사하였다. 위암에서 cyclin B_(2) homologue 의 mRNA 발현은 정상위점막에서는 발현이 매우 미미하였으며, 암조직 및 lymph node 전이암조직에서는 정상위점막에 비해 76%(13/17)에서 증가된 발현이 관찰되었다. Cyclin B_(2) homologue 증가된 발현은 암의 stage와 연관성은 보이지 않았으나 많은 예에서 증가된 발현이 관찰되는 것으로 보아 cyclin B_(2) homologue는 cyclin B_(2)의 cell cycle stimulator로서와 유사한 기능을 가짐으로서 세포의 성장에 필수적일 것으로 추측 될 뿐 아니라 위암의 진행에 있어서도 중요한 역할을 할 것으로 판단되었다. Cyclin D는 4 세포주 모두에서 발현이 있었으나 과대발현은 관찰되지 않았다. 따라서 cyclin D의 과대발현은 위암의 진행에 있어 중요하지 않을 것으로 판단되었다. 위암에서 유전적 변이가 조사된 암억제유전자와 암유전자의 상관관계를 조사한 결과, c-myc 유전자의 과대발현이 있는 모든 예에서 p53의 유전적 변이가 관찰되었다. 또한, c-myc의 과대발현과 p53의 mutation이 동시에 관찰된 예는 위암의 진행성이 높은 악성종양쪽에 분포하였다. 따라서 위암에서 p53의 유전적 변이와 c-myc 유전자 과대발현의 동시존재는 위암을 더욱 더 악성으로 진행시킬 것으로 판단되어 위암 세포주에서 두 유전자의 생리학적 기능을 조사하였다. 위암 세포주에서 c-myc의 발현을 조사한 결과 4 세포주에서 모두 c-myc 발현이 관찰되었으며, SNU-16 세포주에서는 c-myc의 과대 발현이 관찰되었다. SNU-16 세포주에서 DNA level에서 c-myc의 증폭을 조사한 결과 다른 세포주들에 비해 20배 이상의 증폭이 관찰되었다. 따라서 SNU-16 세포주에서 c-myc의 과대 발현은 DNA level애서의 증폭 때문인 것으로 확인되었다. SNU-16 세포주를 혈청이 결여된 배지에서 배양하였을 때 12 시간까지 c-myc 발현의 변화가 관찰되지 않아 c-myc 유전자를 인위적으로 과대발현시킨 효과와 동일하였다. SNU-16 세포주를 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하였을 때 48 시간째에 apoptosis가 일어났으며 이는 c-myc의 과대 발현때문인 것으로 판단되었다. c-myc에 의한 apoptosis의 기전을 조사하기 위하여 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 SNU-16을 배양하면서 시간별로 단백질을 추출하여 apoptosis를 조절하는 p53과 bax의 발현양을 조사한 결과, p53과 bax의 발현이 증가됨을 관찰하였다. 이것으로부터 SNU-16 세포주에서 c-myc의 과대 발현에 의한 apoptosis는 p53과 bax의 발현을 요구함을 알 수 있었다. 따라서 in vivo에서 p53의 변이와 c-myc의 과대발현의 동시 존재는 apoptosis를 저해하여 결과적으로 암세포의 계속적인 생존을 가능케 함으로써 위암을 악성으로 진행시키는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. c-myc 유전자를 과대 발현하는 경우에 있어 치료제의 개발 목적에 의해 각 위암 세포주에서 TNF-α에 대한 영향 및 TNF-α와 c-myc 유전자와의 상관관계를 관찰하였다. 각 위암 세포주에 TNF-α를 50ng/mL에서 1,000 ng/mL까지 첨가하여 48시간 후에 MTT assay로 cell death의 정도를 측정한 결과, TNF-α에 대해 Kato-Ⅲ, SNU-5, MKN-45는 cell death가 10-20 % 정도로 미미하였으나, SNU-16은 60% 정도의 cell death가 관찰되었다. SNU-16 세포주가 TNF-α에 대해 높은 민감성을 보이는 기전을 조사하기 위하여 TNF-α를 처리한 후 시간별로 단백질을 추출하여 p53과 bax의 발현을 관찰하였다. 관찰한 결과 p53과 bax의 발현은 TNF-α를 처리하지 않은 control에 비해 증가됨 을 알 수 있었다. 따라서 c-myc의 과대 발현이 있는 암세포에서 현저한 TNF-α의 암 세포 살해능은 apoptosis의 기전과 동일하였으며, c-myc 의 과대발현이 있는 암에 있어서 TNF-α의 치료적 목적으로의 사용 가능성을 시사하였다. MKN-45는 TNF-α를 처리하였을 경우 많은 세포들이 부착성으로의 형질전환이 관찰되었으며 부착성의 원인을 규명하기 위하여 fibronectin과 fibronectin receptor의 발현을 Western bloting 방법 으로 조사한 결과 TNF-α를 처리하였을 때 fibronectin receptor의 발현의 증가가 관찰되었다. 따라서 TNF-α는 c-myc 유전자의 과대발현이 있는 경우에는 apoptosis를 유발할 수 있으며, C-myc 유전자의 발현이 거의 없는 경우에는 세포의 형태변환을 유도하였다. 암의 악성의 여부는 암의 침윤 및 전이성을 기준으로 판단을 하며, 전이가 일어난 후에는 암의 완치가 거의 불가능하다고 볼 수 있다. 따라서 암침윤 및 전이에 관련된 유전인자들을 위암에서 관찰하여 위암의 침윤 및 전이의 분자생물학적인 기전을 이해하고 진단 및 치료에 있어 기초자료를 제공하고자 하였다. 암침윤 및 전이는 매우 복잡한 과정을 통해 이루어지며 많은 인자들에 의해 영향을 받는다. 이러한 인자들은 extracellular matrix(ECM)를 분해 할 수 있는 단백질분해효소와 이들의 저해제, 세포부착물질 및 전이저해인자 둥이다. 체내에서 잘 알려진 단백질분해효소는 uPA와 matrix metalloproteinases(MMPs) 및 cathepsin L 이며, 세포부착물질은 E-cadherin과 CD44등이 잘 알려져 있고 전이저해인자는 nm23이 잘 알려져 있어 이들 인자들의 유전적 변이를 위암 세포주 및 위압조직에서 관찰하였다. uPA mRNA의 발현은 모든 진행성 위암에서 관찰되었으며, uPA receptor는 복수로 전이된 위암의 경우에 있어서 현저한 발현을 보였으며, 림프절로의 전이된 경우에 있어서는 면역조직화학법에서만이 관찰되었다. uPA의 저해제인 uPAI-1의 발현 변화는 관찰되지 않았다. 위와 같은 결과로 볼 때 uPA-uPAR의 autocrine이 위암에서는 흔히 관찰되며 특히, uPA의 증가된 발현은 전이성 위암의 모든 예에서 관찰되어 전이성의 진단 marker로서 또는 therapy target로서의 가능성을 시사하였으며, 복수로 전이되는 경우에 있어서는 uPAR의 발현 관찰을 진만 marker로 서 사용 가능성을 시사하였다. Type Ⅳ collagenase인 MMP-2와 MMP-9은 각각 3/8 예, 7/8 예에서 mRNA의 증가된 발현이 관찰되었다. 이들은 원발 종양조직보다는 전이 종양조직에서 높은 발현의 증가를 보이는 반면에, uPA는 전이 종양조직 뿐만 아니라 원발 종양조직에서도 높은 발현이 관찰되었다. 이러한 결과로 보아, 위암의 전이의 과정에 있어서 uPA의 발현이 type Ⅳ collagenase의 발현에 비해서 선행될 것으로 사료되며, 다음과 같은 전이의 기전을 추측할 수 있을 것이다. 즉, 위암세포가 uPA 및 uPAR를 발현함으로써 uPAR에 의한 uPA기 활성화가 이루어지며, 연속적으로 uPA에 의해 plasmin에 활성화되고 plasmin에 의해 ECM의 현저한 분해된다. 이러한 상태에서 type Ⅳ collagenase의 발현의 시작은 BM의 분해를 가속화시켜 궁극적으로 전이를 일으킨다. MMPs의 저해제인 tissue inhibitor pf metalloproteinases(TIMPs)는 예상과는 달리 Northern blotting상에서는 원발 종양조직 및 전이 종양조직에서 발현의 증가가 관찰되어 면역조직화학법으로 다시 TIMPs의 단백질 발현을 관찰하였다. 면역조직화학법에서는 암세포에서가 아내라 주위조직의 stromal cell에서 TIMPs의 높은 발현이 관찰되었다. 따라서 TIMPs의 Northern blotting 방법에서 원발 종양조직 및 전이 종양조직에서 발현의 증가는 암세포에 의한 것이 아니라 stromal cell에 의한 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 stromal cell에서 TIMPs의 현저한 생산은 암세포에서 다량 생산된 type Ⅳ collagense에 대한 생체내의 방어조 절기전으로 이해 할 수 있을 것이다. Cathepsin L은 7/8예에서 암조직 및 전이 암조직에서 높은 발현을 보였다. nm23은 오히려 암의 전이를 저해한다는 기존의 보고와는 달리 유전적 변이가 관찰되지 않았으며, 또한 발현의 증가가 전이종양 조직에서 관찰되어 위암에 있어서는 nm23은 암의 전이저해제보다는 다른 역할을 할 것으로 사료되었다. 상피 세포의 결합을 유지하는 E-cadherin은 진행성 위암에서 대부분 발현이 결손되어 위암의 침윤 및 전이의 저해제로 판단되었으며, CD44의 RNA splicing varient도 진행성 위암에서 관찰되었다. 상기의 결과로 볼 때 위암의 침윤 및 전이는 ECM을 분해할 수 있는 다종의 단백질분해효소 발현과, E-cadherin 및 CD44등의 여러인자의 복합적인 작용에 의해 일어남을 알 수 있었다. 상기의 결과들을 종합해볼 때 암억제유전자와 암유전자의 유전적변이에 의한 위암의 발달 및 진행과정을 Figure Ⅳ-1과 같이 정리할 수 있을 것이다. Figure Ⅳ-1에서 볼수 있듯이 p53 유전자의 mutation은 위암의 초기에 발생하여 말기까지 영향을 미치며, 특별히 bfl-1유전자는 양성에서 악성으로 전환는데 매우 특이하게 작용하며 erb-32 및 c-myc유전자의 과대발현이 중요한 역할을 하며 위암의 침윤 및 전이에 있어서는 uPA-uPAR의 autocrine, MMP-9, E-cadherin이 중요한 역할을 하는 것 을 알 수 있다. 그러나 이들 유전자들의 유전적변이는 위암의 발달 및 진행과정에 있어서 각 단계에서 특이하게 작용하는 것이 아니라 서로복합적인 작용에 의해 일어나며 앞으로 자세한 기전이 밝혀지기 위해서는 많은 연구가 진행 되어야 할 것이다. ◁그림 삽입▷(원문을 참조하세요) Figure Ⅳ-1. Genetic alterations in the development of gastric carcinomas. Mutatiuons of the p53 gene and overexpression of c-myc, erb-B2, cycline B2 homologue, bfl-1, ECM degrading protease genes occur most frequenty at the indicated stages of carcinogenesis. Progression to malignancy results from accumulated gentic changes of oncogenes and tumor suppressor genes.
위암은 국내 암발생율의 50 % 정도를 차지하고 있어 발생율이 매우 높은 뿐만 아니라 1960년대 이후 현재까지 그 발생율이 점차 증가추세에 있다. 그러나 서양권에서는 발생율이 매우 희박하여 전세계적으로 다른 암종에 비하여 위암의 발달 및 진행에 대한 연구는 거의 전무하다 볼 수 있다. 따라서 위암의 발달 및 진행과정을 이해하는 것이 요구되어 본 연구에서는 암억제유전자 및 암유전자의 유전적 변이를 위암 세포주 및 위암조직에서 관찰하였으며, 이들 유전자들의 상관관계 및 생리학적 기전을 이해함으로써 위암의 진행과정을 분자생물학적 측면에서 이해하고자 하였다. 암억제유전자중 가장 잘 알려진 p53의 유전적 변이를 조사하기 위하여 PCR-SSCP와 면역조직화학법을 실행한 결과, 위암 세포주 SNU-16, SNU-5, MKN-45, Kato-Ⅲ 모두에서 mutation이 관찰되었으며, 25 예의 위암환자 암조직 중 12 예에서 mutation이 관찰되어 매우 높은 비율(48%)의 유전적 변이가 관찰되었다. 위암조직에서 p53의 유전적 변이는 병리학적 tumor stage와 상관없이 양성종양(adenoma) 및 악성종양 (adenocarcinoma)모두에서 높은 비율로 관찰되어 p53의 유전적 변이는 위암의 발달 및 진행의 초기에 일어날 수 있으며, 악성으로 진행시키는데 있어서도 p53의 유전적 변이가 중요한 역할을 할 것으로 판단되었디. 따라서 위암의 발생 및 악성으로의 진행에 있어 p53의 유전적 변이는 필수 적임을 알 수 있었다. p53에 의해 발현이 조절되는 cyclin dependent kinase의 저해제인 WAF-1/CIP-1/p21 유전자의 mRNA발현은 암조직, 전이 암조직 및 정상 위점막조직에서 p53의 mutation 여부와는 상관없이 일정하였다. 따라서 WAF-1의 발현의 감소는 위암에서 관찰되지 않아 위암의 진행에 있어서 큰 영향을 미치지 않으며, p53에 의해서만 발현이 증가되는 것이 아니라 alternative pathway에 의해서도 발현의 증가가 이루어질 수 있음을 시사하였다. 또 다른 암억제인자인 Rb, MTS-1 유전자는 4 위암 세포주에서 유전적 변이가 관찰되지 않아 위암의 진행에 중요하지 않을 것으로 판단되었다. 암유전자의 대표적인 예인 c-myc 유전자는 발현의 증가에 의해 암을 유발한다고 알려져 있다. 위암환자조직으로부터 RNA를 추출하여 Nothern bloting으로 c-myc mRNA level을 조사한 결과, c-myc 유전자의 과대발현이 24% (9/37)에서 관찰되었다. 이러한 과대발현이 DNA level에서의 증폭때문인지를 확인하기 위하여 Southern blotting을 실행한결과 DNA level에서의 증폭은 17% (3/18)가 관찰되어 위암에서 c-myc 의 과대발현은 DNA level에서 증폭때문인 경우가 33% (3/9)를 차지하였다. bfl-1은 포항공대와 원자력병원의 공동연구에 의해 최초로 발표된 유전자로서 apoptosis를 조절하는 bcl-2 계 유전자의 하나로 Al 유전자와 72%의 sequence-homology를 가져 Al 유전자와 마찬가지로 apoptosis를 저해할 것으로 판단되었다. 위암조직에서 mRNA의 발현을 조사한 결과 정상 위점막조직에서는 발현이 관찰되지 않은 반면, 종양조직 및 림프절전이 종양조직에서 86% (25/29)의 증가된 mRNA 발현이 있었으며 위암 세포주 및 양성종양에서는 bfl-1의 발현은 관찰되지 않았다. bfl-1의 발현정도와 암의 stage와의 통계학적인 관계를 조사한 결과 암의 stage가 낮을수록 bfl-1의 발현이 높은 비율로 증가되었다(p=0.035). 이러한 결과로 위암의 진행에 있어서 bfl-1 발현의 증가는 양성종양에서 초기 약성종양으로 진행하는데 필수적임을 알 수 있었으며, bfl-1의 생리학적 기능은 bcl-2와 마찬가지로 apoptosis를 저해하는 유전자일 것으로 예측되었다. 상피조직의 주된 growth factor인 transforming growth factor(TGF-α)와 이의 receptor인 epidermal growth factor receptor(EGFR) 및 EGFR의 활성화된 형태인 c-erb B_(2) mRNA의 발현을 위압조직에서 관찰하였다. TGF-α 및 EGF receptor는 12.5% (1/8)의 mRNA 발현증대가 있었으며 mRNA의 발현증대가 있는 예는 일치하지 않아 autocrine loop 은 관찰되지 않았다. c-erb-B_(2) mRNA 발현증대는 EGF receptor보다는 높은 비율인 25% (5/20)가 관찰되었다(Figure 1.17, 18), 상기와 같은 결과로 볼 때 thyroid, lung의 암에서 EGF receptor-TGF-α autocrine loop 이 암의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다 하더라도 진행성 위암에서는 관련성이 적은 것으로 보여진다. c-erb-B_(2) mRNA가 5 예에서 발현증대가 보이는 것으로 보아 위암의 진행에 있어서 c-erd-B_(2)는 중요한 역할을 할 것으로 사료되었다. Cyclin B_(2) homologue는 포항공대에서 최초로 cloning한 유전자로서 mouse로부터 얻어진 human cyclin B_(2)와 현저한 sequence homology를 보여 cyclin B_(2)와 같이 cell cycle stimulator로 작용할 것으로 사료되어 위암에서 mRNA의 발현을 조사하였다. 위암에서 cyclin B_(2) homologue 의 mRNA 발현은 정상위점막에서는 발현이 매우 미미하였으며, 암조직 및 lymph node 전이암조직에서는 정상위점막에 비해 76%(13/17)에서 증가된 발현이 관찰되었다. Cyclin B_(2) homologue 증가된 발현은 암의 stage와 연관성은 보이지 않았으나 많은 예에서 증가된 발현이 관찰되는 것으로 보아 cyclin B_(2) homologue는 cyclin B_(2)의 cell cycle stimulator로서와 유사한 기능을 가짐으로서 세포의 성장에 필수적일 것으로 추측 될 뿐 아니라 위암의 진행에 있어서도 중요한 역할을 할 것으로 판단되었다. Cyclin D는 4 세포주 모두에서 발현이 있었으나 과대발현은 관찰되지 않았다. 따라서 cyclin D의 과대발현은 위암의 진행에 있어 중요하지 않을 것으로 판단되었다. 위암에서 유전적 변이가 조사된 암억제유전자와 암유전자의 상관관계를 조사한 결과, c-myc 유전자의 과대발현이 있는 모든 예에서 p53의 유전적 변이가 관찰되었다. 또한, c-myc의 과대발현과 p53의 mutation이 동시에 관찰된 예는 위암의 진행성이 높은 악성종양쪽에 분포하였다. 따라서 위암에서 p53의 유전적 변이와 c-myc 유전자 과대발현의 동시존재는 위암을 더욱 더 악성으로 진행시킬 것으로 판단되어 위암 세포주에서 두 유전자의 생리학적 기능을 조사하였다. 위암 세포주에서 c-myc의 발현을 조사한 결과 4 세포주에서 모두 c-myc 발현이 관찰되었으며, SNU-16 세포주에서는 c-myc의 과대 발현이 관찰되었다. SNU-16 세포주에서 DNA level에서 c-myc의 증폭을 조사한 결과 다른 세포주들에 비해 20배 이상의 증폭이 관찰되었다. 따라서 SNU-16 세포주에서 c-myc의 과대 발현은 DNA level애서의 증폭 때문인 것으로 확인되었다. SNU-16 세포주를 혈청이 결여된 배지에서 배양하였을 때 12 시간까지 c-myc 발현의 변화가 관찰되지 않아 c-myc 유전자를 인위적으로 과대발현시킨 효과와 동일하였다. SNU-16 세포주를 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 배양하였을 때 48 시간째에 apoptosis가 일어났으며 이는 c-myc의 과대 발현때문인 것으로 판단되었다. c-myc에 의한 apoptosis의 기전을 조사하기 위하여 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 SNU-16을 배양하면서 시간별로 단백질을 추출하여 apoptosis를 조절하는 p53과 bax의 발현양을 조사한 결과, p53과 bax의 발현이 증가됨을 관찰하였다. 이것으로부터 SNU-16 세포주에서 c-myc의 과대 발현에 의한 apoptosis는 p53과 bax의 발현을 요구함을 알 수 있었다. 따라서 in vivo에서 p53의 변이와 c-myc의 과대발현의 동시 존재는 apoptosis를 저해하여 결과적으로 암세포의 계속적인 생존을 가능케 함으로써 위암을 악성으로 진행시키는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. c-myc 유전자를 과대 발현하는 경우에 있어 치료제의 개발 목적에 의해 각 위암 세포주에서 TNF-α에 대한 영향 및 TNF-α와 c-myc 유전자와의 상관관계를 관찰하였다. 각 위암 세포주에 TNF-α를 50ng/mL에서 1,000 ng/mL까지 첨가하여 48시간 후에 MTT assay로 cell death의 정도를 측정한 결과, TNF-α에 대해 Kato-Ⅲ, SNU-5, MKN-45는 cell death가 10-20 % 정도로 미미하였으나, SNU-16은 60% 정도의 cell death가 관찰되었다. SNU-16 세포주가 TNF-α에 대해 높은 민감성을 보이는 기전을 조사하기 위하여 TNF-α를 처리한 후 시간별로 단백질을 추출하여 p53과 bax의 발현을 관찰하였다. 관찰한 결과 p53과 bax의 발현은 TNF-α를 처리하지 않은 control에 비해 증가됨 을 알 수 있었다. 따라서 c-myc의 과대 발현이 있는 암세포에서 현저한 TNF-α의 암 세포 살해능은 apoptosis의 기전과 동일하였으며, c-myc 의 과대발현이 있는 암에 있어서 TNF-α의 치료적 목적으로의 사용 가능성을 시사하였다. MKN-45는 TNF-α를 처리하였을 경우 많은 세포들이 부착성으로의 형질전환이 관찰되었으며 부착성의 원인을 규명하기 위하여 fibronectin과 fibronectin receptor의 발현을 Western bloting 방법 으로 조사한 결과 TNF-α를 처리하였을 때 fibronectin receptor의 발현의 증가가 관찰되었다. 따라서 TNF-α는 c-myc 유전자의 과대발현이 있는 경우에는 apoptosis를 유발할 수 있으며, C-myc 유전자의 발현이 거의 없는 경우에는 세포의 형태변환을 유도하였다. 암의 악성의 여부는 암의 침윤 및 전이성을 기준으로 판단을 하며, 전이가 일어난 후에는 암의 완치가 거의 불가능하다고 볼 수 있다. 따라서 암침윤 및 전이에 관련된 유전인자들을 위암에서 관찰하여 위암의 침윤 및 전이의 분자생물학적인 기전을 이해하고 진단 및 치료에 있어 기초자료를 제공하고자 하였다. 암침윤 및 전이는 매우 복잡한 과정을 통해 이루어지며 많은 인자들에 의해 영향을 받는다. 이러한 인자들은 extracellular matrix(ECM)를 분해 할 수 있는 단백질분해효소와 이들의 저해제, 세포부착물질 및 전이저해인자 둥이다. 체내에서 잘 알려진 단백질분해효소는 uPA와 matrix metalloproteinases(MMPs) 및 cathepsin L 이며, 세포부착물질은 E-cadherin과 CD44등이 잘 알려져 있고 전이저해인자는 nm23이 잘 알려져 있어 이들 인자들의 유전적 변이를 위암 세포주 및 위압조직에서 관찰하였다. uPA mRNA의 발현은 모든 진행성 위암에서 관찰되었으며, uPA receptor는 복수로 전이된 위암의 경우에 있어서 현저한 발현을 보였으며, 림프절로의 전이된 경우에 있어서는 면역조직화학법에서만이 관찰되었다. uPA의 저해제인 uPAI-1의 발현 변화는 관찰되지 않았다. 위와 같은 결과로 볼 때 uPA-uPAR의 autocrine이 위암에서는 흔히 관찰되며 특히, uPA의 증가된 발현은 전이성 위암의 모든 예에서 관찰되어 전이성의 진단 marker로서 또는 therapy target로서의 가능성을 시사하였으며, 복수로 전이되는 경우에 있어서는 uPAR의 발현 관찰을 진만 marker로 서 사용 가능성을 시사하였다. Type Ⅳ collagenase인 MMP-2와 MMP-9은 각각 3/8 예, 7/8 예에서 mRNA의 증가된 발현이 관찰되었다. 이들은 원발 종양조직보다는 전이 종양조직에서 높은 발현의 증가를 보이는 반면에, uPA는 전이 종양조직 뿐만 아니라 원발 종양조직에서도 높은 발현이 관찰되었다. 이러한 결과로 보아, 위암의 전이의 과정에 있어서 uPA의 발현이 type Ⅳ collagenase의 발현에 비해서 선행될 것으로 사료되며, 다음과 같은 전이의 기전을 추측할 수 있을 것이다. 즉, 위암세포가 uPA 및 uPAR를 발현함으로써 uPAR에 의한 uPA기 활성화가 이루어지며, 연속적으로 uPA에 의해 plasmin에 활성화되고 plasmin에 의해 ECM의 현저한 분해된다. 이러한 상태에서 type Ⅳ collagenase의 발현의 시작은 BM의 분해를 가속화시켜 궁극적으로 전이를 일으킨다. MMPs의 저해제인 tissue inhibitor pf metalloproteinases(TIMPs)는 예상과는 달리 Northern blotting상에서는 원발 종양조직 및 전이 종양조직에서 발현의 증가가 관찰되어 면역조직화학법으로 다시 TIMPs의 단백질 발현을 관찰하였다. 면역조직화학법에서는 암세포에서가 아내라 주위조직의 stromal cell에서 TIMPs의 높은 발현이 관찰되었다. 따라서 TIMPs의 Northern blotting 방법에서 원발 종양조직 및 전이 종양조직에서 발현의 증가는 암세포에 의한 것이 아니라 stromal cell에 의한 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 stromal cell에서 TIMPs의 현저한 생산은 암세포에서 다량 생산된 type Ⅳ collagense에 대한 생체내의 방어조 절기전으로 이해 할 수 있을 것이다. Cathepsin L은 7/8예에서 암조직 및 전이 암조직에서 높은 발현을 보였다. nm23은 오히려 암의 전이를 저해한다는 기존의 보고와는 달리 유전적 변이가 관찰되지 않았으며, 또한 발현의 증가가 전이종양 조직에서 관찰되어 위암에 있어서는 nm23은 암의 전이저해제보다는 다른 역할을 할 것으로 사료되었다. 상피 세포의 결합을 유지하는 E-cadherin은 진행성 위암에서 대부분 발현이 결손되어 위암의 침윤 및 전이의 저해제로 판단되었으며, CD44의 RNA splicing varient도 진행성 위암에서 관찰되었다. 상기의 결과로 볼 때 위암의 침윤 및 전이는 ECM을 분해할 수 있는 다종의 단백질분해효소 발현과, E-cadherin 및 CD44등의 여러인자의 복합적인 작용에 의해 일어남을 알 수 있었다. 상기의 결과들을 종합해볼 때 암억제유전자와 암유전자의 유전적변이에 의한 위암의 발달 및 진행과정을 Figure Ⅳ-1과 같이 정리할 수 있을 것이다. Figure Ⅳ-1에서 볼수 있듯이 p53 유전자의 mutation은 위암의 초기에 발생하여 말기까지 영향을 미치며, 특별히 bfl-1유전자는 양성에서 악성으로 전환는데 매우 특이하게 작용하며 erb-32 및 c-myc유전자의 과대발현이 중요한 역할을 하며 위암의 침윤 및 전이에 있어서는 uPA-uPAR의 autocrine, MMP-9, E-cadherin이 중요한 역할을 하는 것 을 알 수 있다. 그러나 이들 유전자들의 유전적변이는 위암의 발달 및 진행과정에 있어서 각 단계에서 특이하게 작용하는 것이 아니라 서로복합적인 작용에 의해 일어나며 앞으로 자세한 기전이 밝혀지기 위해서는 많은 연구가 진행 되어야 할 것이다. ◁그림 삽입▷(원문을 참조하세요) Figure Ⅳ-1. Genetic alterations in the development of gastric carcinomas. Mutatiuons of the p53 gene and overexpression of c-myc, erb-B2, cycline B2 homologue, bfl-1, ECM degrading protease genes occur most frequenty at the indicated stages of carcinogenesis. Progression to malignancy results from accumulated gentic changes of oncogenes and tumor suppressor genes.
Knowledge accumlated by the recent progress in molecular genetics has supported the concept of a multistep process in the development of cancer. In each step of this multistep carcinogenesis, the malignant transformation is generally accepted to occur through interactions between a series of altered...
Knowledge accumlated by the recent progress in molecular genetics has supported the concept of a multistep process in the development of cancer. In each step of this multistep carcinogenesis, the malignant transformation is generally accepted to occur through interactions between a series of altered oncogenes and supperssor genes. Stomach cancer is the most common cancer in Korea. However, little is known about the molecular and genetic basis that contributes to the development and progression of stomach cancer. In this study, to understand development and progression of stomach cancer in molecualr level, we analysed the variety of tumor suppressor gene, oncogenes and metastasis related genes including p53, WAF-1. MTS-1, Bb, c-myc, bfl-1, cyclin B2 homologue, TGF-α, Erb-B2, EGFR, ECM degrading enzymes and its inhibitors, nm23 E-cadherin, and CD44. We conducted to investigate the p53 gene alterations in 25 surgically-resected gastic adenocarcinoma in korea cancer center hospital by PCR-SSCP for exone 4-8 and immunohistocytochemistry with anti-p53 antibody. Forty-eight % of the 25 primary gastric cancers were considered to have mutations of the p53 gene. These results suggest that p53 mutations is not an infrequent event in primary gastric cancer and the p53 gene plays an important role in the carcinogenesis process of gastric cancer. WAF-1 induction was associated with wild-type but not mutant p53 activation. A p53 binding site in the WAF-1 gene upstream region on a heterologous gene. The exciting kinases suggested a link between p53 expression of WAF-1 was constant in normal mucosa, primary tumor and metastatic tumor regardless of p53 state. Therefore WAF-1 is not a importnat factor in stomach cancer progression. Dletions of another tumor suppressor genes, MTS-1 and Rb, were nor detected in stomach cancer cell lines. In stomach cancer patient tissues, 24% (9/37) showed elevated levels of c-Myc mRNA in primary or metastatic tumor tissues, and c-myc gene amplification was detected in 17% (3/18). A new cDNA clone which is homologous to bcl-2, named as bfl-1 has been isolated from a human fetal liver at 22-week of gestation. It is suggested that bfl-1 is a new member of the bcl-2 realted gene. To investigate the possible role of bfl-1 gene in human carcinogensis, we analysed the expression of the bfl-1 gene in human gastric cancer tissues. Eighty-six % (25/29) showed elevated levels of Bfl-1 mRNA in primary or metastatic gastric cancer tissues. Interestingly, the levels of Bfl-1 expression was decrease according to the stages (P=.0.035). Therefore, bfl-1 gene may be an early genetic event in the carcinogenesis of gastric cancer. To demenstrate the overxpression of Erb-B_(2) in advanced gastric cancer, we undertaken Northern blot assay using a specific human c-Erb-B_(2) complememtary DNA probe in 20 specimens. Also, EGF receptor-transforming growth factor-α(TGF-α) autocrine-loop may occur, we exmined mRNA levels of EGF receptor and TGF-α. Evaluted expression of c-Erb-B_(2) mRNA detected in 25% (5/20) and EGF, receptor and TGF-α were detected in 12.5% (1/8), 12.5% (1/8), respectively. Specimens which overexpress EGF receptor and TGF-α mRNA are not identical. Therefore, EGF-receptor-TGF-α autocrine-loop may be rarely involved in advanced gastic cancer despite active in several other humana cancers. In human gastric cancer, we suppose that c-Erb-B_(2) and unidentified growth factor paracrine is associated with activation of tumor cell proliferation. A new cDNA clone, we called cyclin B_(2) homologue isolate from human fetal liver, homologous to mouse cyclin B_(2) was discovered by PoHang University of Science and Technology. Evaluated expression of cyclin B_(2) homologue mRNA was detected in 76% (13/17). Therefore, we speculate that cyclin B(2) homologue may play important role in stomach cancer progression, and act as a cell cycle stimulator similar to cyclim B_(2). c-Myc regulates cell proliferation and contributes to tumorigenesis when its expression is deregulated. Recently, it has been reported that enfoced c-Myc expression may also induce apoptosis in some c-Myc transfected cell line systems. But the precise mechanism by which c-Myc mediates apoptosis is not elucidated in caner cell. Therefore, we investigated the mechanism of c-Myc induced apoptosis in stomach cancer cell line, SNU-16, which is highly expressed c-Myc due to gene amplification. All cells of SNU-16 died after 48 hours under condition of serum-starved. Cell death of SNU-16 cell line in serum-free media showed DNA fragmentation in agarose gel. We examined the p53 and Bax expression levels following serum deprivation by Western blot analysis whether the c-Myc-induced apoptosis in SNU-16 is dependent on p53. p53 protein level was increased after serum deprivation and p53 down-regulated molecule, Bax also was increased. Thus, c-Myc may induce apoptosis via p53 and Bax in SNU-16 stomach cancer cell line. Additioally, we investigated relationship between loss of tumor suppressor genes and oncogenes' genetic alterations in stomach cancer patient tissus. p5. mutation was detected in all cases of elevated expression of c-myc in vivo samples. Moreover, deregulated expression of c-Myc and p53 mutation are generally found in aggressive tumor, stage Ⅳ. Therefore, elevated expression of c-Myc and p53 mutation concomitantly may play al important role in stomach cancer progression. Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) is a multifunctional cytokines which is cytotoxic for som tumor cells and transformed cells. We alalysed the cytotoxic effect of TNF-αon stomach cancer cell lines to exmine possibility which is feasible in using of TNF-αas a therepeutic agents. SNU-16 cell line, overxpressed c-Myc, showed a increased sensitivity in four-folds compared to others stomach cancer cell lines. The molecualr mechanisms whic render SNU-16 cell line sensitive to the cytotoxic action of TNF-α are activation of p53 and Bax which are same as mechnism of c-Myc-induced apoptosis. This results suggest that the TNF-α as a therapeutic agents usable to stomach cancers which overexpress c-Myc. The invasion and metastasis of tumor cells is one of the most frequently developed intrinsic problems that cause mortality in clinical medicine. Proteoytic enzymes are known to facilitate the invasion and metastasis of tumor cell by degrading the components of basement membrane and extracellular matrix. Conversely, proteolytic enzyme inhibitors may inhibit invasion and metastasis in some in vitro systems. The present study was undertaken to determine the role of proteolytic enzymes and theirs inhibitors in the invasion phenotype of gastric cancer and the regulation of those expression. We investigted mRNA and protein expression of the proteolytic enzymes(uPA, type Ⅳ collagenases and cathepsin L) and their inhibitor(uPAI-I, TIMP-1 and 2) by Northern blot analysis and immunohistochemistry in paired gastric cancer tissies. uPA mRNA expression was elevated in all primary and secondary tumor tissues (25/25), but uPAI-I mRNA expression was not different between tumor tissues and normal mucosa. uPAR mRNA expression was detected only in tumor extracted from ascitic fluid. mRNA was detected only in tumor extracted from ascitic fluid. mRNA expression of type Ⅳ collagenases, MMP-2, MMP-9, and cathepsin L was elevated in 3(37.5%), 7(787.5%) and 7(87.5%) cases out of 8 primary and secondary tumor tissues repectively. Unexpectedly, TIMP-1,2 expression were also elevated in tumor tissues. However, immunohistochemical staining of TIMPs was strongly demonstrated in stroma but not in tumor. Also, mRNA of proteolytic enzymes were detected in stomach cancer cell lines. These results suggested that the proteolytic enzymes expression in most gastric cancer may be closely associated with tumor invasion and metastasis.
Knowledge accumlated by the recent progress in molecular genetics has supported the concept of a multistep process in the development of cancer. In each step of this multistep carcinogenesis, the malignant transformation is generally accepted to occur through interactions between a series of altered oncogenes and supperssor genes. Stomach cancer is the most common cancer in Korea. However, little is known about the molecular and genetic basis that contributes to the development and progression of stomach cancer. In this study, to understand development and progression of stomach cancer in molecualr level, we analysed the variety of tumor suppressor gene, oncogenes and metastasis related genes including p53, WAF-1. MTS-1, Bb, c-myc, bfl-1, cyclin B2 homologue, TGF-α, Erb-B2, EGFR, ECM degrading enzymes and its inhibitors, nm23 E-cadherin, and CD44. We conducted to investigate the p53 gene alterations in 25 surgically-resected gastic adenocarcinoma in korea cancer center hospital by PCR-SSCP for exone 4-8 and immunohistocytochemistry with anti-p53 antibody. Forty-eight % of the 25 primary gastric cancers were considered to have mutations of the p53 gene. These results suggest that p53 mutations is not an infrequent event in primary gastric cancer and the p53 gene plays an important role in the carcinogenesis process of gastric cancer. WAF-1 induction was associated with wild-type but not mutant p53 activation. A p53 binding site in the WAF-1 gene upstream region on a heterologous gene. The exciting kinases suggested a link between p53 expression of WAF-1 was constant in normal mucosa, primary tumor and metastatic tumor regardless of p53 state. Therefore WAF-1 is not a importnat factor in stomach cancer progression. Dletions of another tumor suppressor genes, MTS-1 and Rb, were nor detected in stomach cancer cell lines. In stomach cancer patient tissues, 24% (9/37) showed elevated levels of c-Myc mRNA in primary or metastatic tumor tissues, and c-myc gene amplification was detected in 17% (3/18). A new cDNA clone which is homologous to bcl-2, named as bfl-1 has been isolated from a human fetal liver at 22-week of gestation. It is suggested that bfl-1 is a new member of the bcl-2 realted gene. To investigate the possible role of bfl-1 gene in human carcinogensis, we analysed the expression of the bfl-1 gene in human gastric cancer tissues. Eighty-six % (25/29) showed elevated levels of Bfl-1 mRNA in primary or metastatic gastric cancer tissues. Interestingly, the levels of Bfl-1 expression was decrease according to the stages (P=.0.035). Therefore, bfl-1 gene may be an early genetic event in the carcinogenesis of gastric cancer. To demenstrate the overxpression of Erb-B_(2) in advanced gastric cancer, we undertaken Northern blot assay using a specific human c-Erb-B_(2) complememtary DNA probe in 20 specimens. Also, EGF receptor-transforming growth factor-α(TGF-α) autocrine-loop may occur, we exmined mRNA levels of EGF receptor and TGF-α. Evaluted expression of c-Erb-B_(2) mRNA detected in 25% (5/20) and EGF, receptor and TGF-α were detected in 12.5% (1/8), 12.5% (1/8), respectively. Specimens which overexpress EGF receptor and TGF-α mRNA are not identical. Therefore, EGF-receptor-TGF-α autocrine-loop may be rarely involved in advanced gastic cancer despite active in several other humana cancers. In human gastric cancer, we suppose that c-Erb-B_(2) and unidentified growth factor paracrine is associated with activation of tumor cell proliferation. A new cDNA clone, we called cyclin B_(2) homologue isolate from human fetal liver, homologous to mouse cyclin B_(2) was discovered by PoHang University of Science and Technology. Evaluated expression of cyclin B_(2) homologue mRNA was detected in 76% (13/17). Therefore, we speculate that cyclin B(2) homologue may play important role in stomach cancer progression, and act as a cell cycle stimulator similar to cyclim B_(2). c-Myc regulates cell proliferation and contributes to tumorigenesis when its expression is deregulated. Recently, it has been reported that enfoced c-Myc expression may also induce apoptosis in some c-Myc transfected cell line systems. But the precise mechanism by which c-Myc mediates apoptosis is not elucidated in caner cell. Therefore, we investigated the mechanism of c-Myc induced apoptosis in stomach cancer cell line, SNU-16, which is highly expressed c-Myc due to gene amplification. All cells of SNU-16 died after 48 hours under condition of serum-starved. Cell death of SNU-16 cell line in serum-free media showed DNA fragmentation in agarose gel. We examined the p53 and Bax expression levels following serum deprivation by Western blot analysis whether the c-Myc-induced apoptosis in SNU-16 is dependent on p53. p53 protein level was increased after serum deprivation and p53 down-regulated molecule, Bax also was increased. Thus, c-Myc may induce apoptosis via p53 and Bax in SNU-16 stomach cancer cell line. Additioally, we investigated relationship between loss of tumor suppressor genes and oncogenes' genetic alterations in stomach cancer patient tissus. p5. mutation was detected in all cases of elevated expression of c-myc in vivo samples. Moreover, deregulated expression of c-Myc and p53 mutation are generally found in aggressive tumor, stage Ⅳ. Therefore, elevated expression of c-Myc and p53 mutation concomitantly may play al important role in stomach cancer progression. Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) is a multifunctional cytokines which is cytotoxic for som tumor cells and transformed cells. We alalysed the cytotoxic effect of TNF-αon stomach cancer cell lines to exmine possibility which is feasible in using of TNF-αas a therepeutic agents. SNU-16 cell line, overxpressed c-Myc, showed a increased sensitivity in four-folds compared to others stomach cancer cell lines. The molecualr mechanisms whic render SNU-16 cell line sensitive to the cytotoxic action of TNF-α are activation of p53 and Bax which are same as mechnism of c-Myc-induced apoptosis. This results suggest that the TNF-α as a therapeutic agents usable to stomach cancers which overexpress c-Myc. The invasion and metastasis of tumor cells is one of the most frequently developed intrinsic problems that cause mortality in clinical medicine. Proteoytic enzymes are known to facilitate the invasion and metastasis of tumor cell by degrading the components of basement membrane and extracellular matrix. Conversely, proteolytic enzyme inhibitors may inhibit invasion and metastasis in some in vitro systems. The present study was undertaken to determine the role of proteolytic enzymes and theirs inhibitors in the invasion phenotype of gastric cancer and the regulation of those expression. We investigted mRNA and protein expression of the proteolytic enzymes(uPA, type Ⅳ collagenases and cathepsin L) and their inhibitor(uPAI-I, TIMP-1 and 2) by Northern blot analysis and immunohistochemistry in paired gastric cancer tissies. uPA mRNA expression was elevated in all primary and secondary tumor tissues (25/25), but uPAI-I mRNA expression was not different between tumor tissues and normal mucosa. uPAR mRNA expression was detected only in tumor extracted from ascitic fluid. mRNA was detected only in tumor extracted from ascitic fluid. mRNA expression of type Ⅳ collagenases, MMP-2, MMP-9, and cathepsin L was elevated in 3(37.5%), 7(787.5%) and 7(87.5%) cases out of 8 primary and secondary tumor tissues repectively. Unexpectedly, TIMP-1,2 expression were also elevated in tumor tissues. However, immunohistochemical staining of TIMPs was strongly demonstrated in stroma but not in tumor. Also, mRNA of proteolytic enzymes were detected in stomach cancer cell lines. These results suggested that the proteolytic enzymes expression in most gastric cancer may be closely associated with tumor invasion and metastasis.
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