[학위논문]Hepatitus B virus 와 Woodchuck hepatitis virus의 core와 polymerase의 complementation 연구 Complementation study of core and polymerase between hepatitis B virus and woodchuck hepatitis virus원문보기
Hepatitis B virus (HBV)는 만성적인 간 질환과 Hepatocellular carcinoma를 일으키는 주원인으로 알려져 있는 바이러스로서 Hepadnavirus family에 속한다. 이와 더불어 Hepadnavirus family에는 Woodchuck hepatitis virus (WHV), Ground squirrel hepatitis virus, Duck hepatitis B virus (DHBV) 등이 있다. 이중 WHV는 Woodchuck이라는 ...
Hepatitis B virus (HBV)는 만성적인 간 질환과 Hepatocellular carcinoma를 일으키는 주원인으로 알려져 있는 바이러스로서 Hepadnavirus family에 속한다. 이와 더불어 Hepadnavirus family에는 Woodchuck hepatitis virus (WHV), Ground squirrel hepatitis virus, Duck hepatitis B virus (DHBV) 등이 있다. 이중 WHV는 Woodchuck이라는 포유 동물을 숙주로하는 바이러스로 HBV와 nucleotide sequence의 homology는 78 %라고 알려져 있다.
Hepadnavirus는RNA intermediate인 pregenomic RNA의 reversetranscription에 의해 그들의 genome이 replication된다. Replication의 첫 단계는 pregenomic RNA가 core particle내로 encapsidation되는 것이다. Encapsidation 은 structural protein인 core와 polymerase 그리고 pregenomic RNA의 interaction에 의해 이루어진다. 먼저 polymerase는 pregenomic RNA의 5'end에 있는 stem-loop구조인 ε에 결합하게 되며 이 polymerase-pregenomic RNA complex를 core protein이 인식해 encapsidation이 이루어진다. 이렇게 encapsidation이 일어나고 나면 capsid 내에서 pregenomic RNA의 reverse transcription으로 DNA synthesis가 이루어진다. 우선, pregenomic RNA는 template로 하여 minus-strand DNA (single-strand DNA)가 합성된다. 다음, 이 minus-strand DNA 를 template로 하여 plus-strand DNA가 합성된다. 이때, plus-strand synthesis에 작용 하는 RNA primer 의 translocation과 template switching이 수반되면서 relaxed-circular DNA가 합성된다.
본 연구에서는 HBV의 replication mechanism에 있어서 core protein과 polymerase가 어떠한 역활을 수행 하는지 알아보기 위해 WHV와 HBV 간의 trans-complementation을 시도하였다. 즉, WHV 와 HBV의 core, polymerase가 각각 HBV와 WHV의 pregenomic RNA를 template로 인식하여 DNA복제의 support 가 가능한지 여부를 조사하였다.
우리는 이 연구를 위해 HBV와WHV의 core와 poymerase을 각각 발현 하는 plasmid를 제작 하였으며 이 plasmid를 HBV 혹은 WHV 의 5'-end 의 ε구조를 가지는 template plasmid와 함께 여러 조합으로 Huh 7 cell에 cotransfection 시켰다. 그 후 transfection한 Huh 7 cell에서 virus의 core DNA를 추출해 Southern blot 을 통해 각 조합에서의 replication 양상을 관찰 했다.
그 결과 HBV core 대신에 WHV의 core를 HBV pregenomic RNA에 제공할 경우 replication intermediates인 single-strand DNA와 duplex-linear DNA는 wild-type과 유사하게 형성되지만 HBV의 DNA 합성에 있어서 mature한 형태인 relaxed-circular형의 DNA가 거의 형성 되지 않는 다는 것을 관찰하였다. 본 연구결과는 core 가 HBV replication mechanism 중 plus-strand 합성에 있어서 primer 의 translocation이나 template switching에 관여 할 것임을 암시한다.
흥미롭게도, HBV pregenomic RNA에서 WHV와 HBV core를 1:1로 제공한 경우에 HBV core만을 제공한 경우와 유사하게 relaxed-circular DNA형성을 관찰하였다. 이 결과는 실제 plus-strand 합성에 관여하는 core protein은 HBV 의 icosahedral nucleocapsid를 구성하는 240개의 core protein중에 120개 이하 일 것이라는 추측을 하게 한다.
본 연구를 바탕으로 앞으로의 연구를 replication mechanism에 관여하는 core와 polymerase의 domain을 mapping하여 hepadnaviral genome replication에 있어서 host specificity를 결정해주는 domain을 mapping할 뿐만 아니라 reverse transcription mechanism을 분자수준에서 이해하는데 새로운 재료를 제공해줄 수 있을 것이다.
Hepatitis B virus (HBV)는 만성적인 간 질환과 Hepatocellular carcinoma를 일으키는 주원인으로 알려져 있는 바이러스로서 Hepadnavirus family에 속한다. 이와 더불어 Hepadnavirus family에는 Woodchuck hepatitis virus (WHV), Ground squirrel hepatitis virus, Duck hepatitis B virus (DHBV) 등이 있다. 이중 WHV는 Woodchuck이라는 포유 동물을 숙주로하는 바이러스로 HBV와 nucleotide sequence의 homology는 78 %라고 알려져 있다.
Hepadnavirus는RNA intermediate인 pregenomic RNA의 reversetranscription에 의해 그들의 genome이 replication된다. Replication의 첫 단계는 pregenomic RNA가 core particle내로 encapsidation되는 것이다. Encapsidation 은 structural protein인 core와 polymerase 그리고 pregenomic RNA의 interaction에 의해 이루어진다. 먼저 polymerase는 pregenomic RNA의 5'end에 있는 stem-loop구조인 ε에 결합하게 되며 이 polymerase-pregenomic RNA complex를 core protein이 인식해 encapsidation이 이루어진다. 이렇게 encapsidation이 일어나고 나면 capsid 내에서 pregenomic RNA의 reverse transcription으로 DNA synthesis가 이루어진다. 우선, pregenomic RNA는 template로 하여 minus-strand DNA (single-strand DNA)가 합성된다. 다음, 이 minus-strand DNA 를 template로 하여 plus-strand DNA가 합성된다. 이때, plus-strand synthesis에 작용 하는 RNA primer 의 translocation과 template switching이 수반되면서 relaxed-circular DNA가 합성된다.
본 연구에서는 HBV의 replication mechanism에 있어서 core protein과 polymerase가 어떠한 역활을 수행 하는지 알아보기 위해 WHV와 HBV 간의 trans-complementation을 시도하였다. 즉, WHV 와 HBV의 core, polymerase가 각각 HBV와 WHV의 pregenomic RNA를 template로 인식하여 DNA복제의 support 가 가능한지 여부를 조사하였다.
우리는 이 연구를 위해 HBV와WHV의 core와 poymerase을 각각 발현 하는 plasmid를 제작 하였으며 이 plasmid를 HBV 혹은 WHV 의 5'-end 의 ε구조를 가지는 template plasmid와 함께 여러 조합으로 Huh 7 cell에 cotransfection 시켰다. 그 후 transfection한 Huh 7 cell에서 virus의 core DNA를 추출해 Southern blot 을 통해 각 조합에서의 replication 양상을 관찰 했다.
그 결과 HBV core 대신에 WHV의 core를 HBV pregenomic RNA에 제공할 경우 replication intermediates인 single-strand DNA와 duplex-linear DNA는 wild-type과 유사하게 형성되지만 HBV의 DNA 합성에 있어서 mature한 형태인 relaxed-circular형의 DNA가 거의 형성 되지 않는 다는 것을 관찰하였다. 본 연구결과는 core 가 HBV replication mechanism 중 plus-strand 합성에 있어서 primer 의 translocation이나 template switching에 관여 할 것임을 암시한다.
흥미롭게도, HBV pregenomic RNA에서 WHV와 HBV core를 1:1로 제공한 경우에 HBV core만을 제공한 경우와 유사하게 relaxed-circular DNA형성을 관찰하였다. 이 결과는 실제 plus-strand 합성에 관여하는 core protein은 HBV 의 icosahedral nucleocapsid를 구성하는 240개의 core protein중에 120개 이하 일 것이라는 추측을 하게 한다.
본 연구를 바탕으로 앞으로의 연구를 replication mechanism에 관여하는 core와 polymerase의 domain을 mapping하여 hepadnaviral genome replication에 있어서 host specificity를 결정해주는 domain을 mapping할 뿐만 아니라 reverse transcription mechanism을 분자수준에서 이해하는데 새로운 재료를 제공해줄 수 있을 것이다.
Hepatitis B Virus (HBV) is a prototype virus in the hepadnavirus family known as the primary source that gives rise to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Included in the hepadnavirus family are woodchuck hepatitis virus (WHV), ground squirrel hepatitis virus, duck hepatitis B virus ...
Hepatitis B Virus (HBV) is a prototype virus in the hepadnavirus family known as the primary source that gives rise to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Included in the hepadnavirus family are woodchuck hepatitis virus (WHV), ground squirrel hepatitis virus, duck hepatitis B virus (DHBV). Among these, WHV has 78 % nucleotide sequence homology with HBV. The genomes of hepadnaviruses are replicated by reverse transcription of RNA intermediate, which is referred to as pregenomic RNA. The first step of replication is for pregenomic RNA to be encapsidated inside of core. Encapsidation is brought about by the interaction of pregenomic RNA and the structural proteins, core and polymerase. First, the viral polymerase (pol) binds to stem-loop structure, epsilon, which is found at the 5` end of the pregenomic RNA. Then, core protein recognizes this polymerase-pregenomic DNA complex, and encapsidation takes place. Subsequently, replication takes place through reverse transcription of pregenomic RNA inside the capsid. Thus in the genome replication of HBV, core and pol are essential in addition to the pregenomic RNA template. In this study, transcomplementation between WHV and HBV viral proteins was attempted in order to explore the roles of core and pol in the genome replication of HBV. It was examined whether or not WHV and HBVs’ core and pol would recognize pregenomic RNA of HBV as a template, respectively, and support subsequent reverse transciption. For this study, I constructed plasmids expressing core and pol of both HBV and WHV and cotransfected these plasmids in Huh7 cells in several combinations with template plasmids having 5` end epsilon structures of HBV. Afterwards, viral core DNA was extracted from the transfected Huh7 cells and analyzed by Southern blot to examine replication intermediates within cytoplasmic core particles. The data indicated that when HBV pregenomic RNA was complemented by WHV core protein, duplex-linear DNA as well as singlestrand DNA replication intermediates were normally detected, but a significantly reduced amount of relaxed-circular form DNA was detected in cytoplasmic core particles. Based on the results of this study, I speculate that core protein, in particular, participates in template switching or primer translocation during plus-strand DNA synthesis of reverse transcription. Generation of chimeric core particle between HBV and WHV will allow us to determine the subdomain of core protein that contributes to the plus-strand primer translocation process during reverse transciption.
Hepatitis B Virus (HBV) is a prototype virus in the hepadnavirus family known as the primary source that gives rise to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Included in the hepadnavirus family are woodchuck hepatitis virus (WHV), ground squirrel hepatitis virus, duck hepatitis B virus (DHBV). Among these, WHV has 78 % nucleotide sequence homology with HBV. The genomes of hepadnaviruses are replicated by reverse transcription of RNA intermediate, which is referred to as pregenomic RNA. The first step of replication is for pregenomic RNA to be encapsidated inside of core. Encapsidation is brought about by the interaction of pregenomic RNA and the structural proteins, core and polymerase. First, the viral polymerase (pol) binds to stem-loop structure, epsilon, which is found at the 5` end of the pregenomic RNA. Then, core protein recognizes this polymerase-pregenomic DNA complex, and encapsidation takes place. Subsequently, replication takes place through reverse transcription of pregenomic RNA inside the capsid. Thus in the genome replication of HBV, core and pol are essential in addition to the pregenomic RNA template. In this study, transcomplementation between WHV and HBV viral proteins was attempted in order to explore the roles of core and pol in the genome replication of HBV. It was examined whether or not WHV and HBVs’ core and pol would recognize pregenomic RNA of HBV as a template, respectively, and support subsequent reverse transciption. For this study, I constructed plasmids expressing core and pol of both HBV and WHV and cotransfected these plasmids in Huh7 cells in several combinations with template plasmids having 5` end epsilon structures of HBV. Afterwards, viral core DNA was extracted from the transfected Huh7 cells and analyzed by Southern blot to examine replication intermediates within cytoplasmic core particles. The data indicated that when HBV pregenomic RNA was complemented by WHV core protein, duplex-linear DNA as well as singlestrand DNA replication intermediates were normally detected, but a significantly reduced amount of relaxed-circular form DNA was detected in cytoplasmic core particles. Based on the results of this study, I speculate that core protein, in particular, participates in template switching or primer translocation during plus-strand DNA synthesis of reverse transcription. Generation of chimeric core particle between HBV and WHV will allow us to determine the subdomain of core protein that contributes to the plus-strand primer translocation process during reverse transciption.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.