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문제 정의
- 따라서 본 연구는 지아디아 포낭이 저농도로 존재하는 하천수 시료에 PCR 및 RT-PCR기법을 적용함으로써 표준시험 방법을 보완하여 보건 위생학적으로 매우 중요한 의미를 갖는 활성 및 사람 감염성 종 여부를 평가하고자 하였다. 특히 우리나라 최대 상수원인 한강 수계에서 사람 감염성 종인 G.
- 특히 우리나라 최대 상수원인 한강 수계에서 사람 감염성 종인 G. #에 의한 오염 정도를 파악하고 그 활성 여부까지 평가하여, 표준 시험법에 기초한 실태조사 결과를 보완하고, 향후 상수도 분야의 원생동물 대책 수립에 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 2.2절에서 얻어진 IMS 정제액의 일부를 슬라이드 글라스 위에 적용하여 지아디아 항체가 표지된 면역형광항체 염색액(Merifluor Cryptosporidium / Giardia, Meridian Bioscience) 으로 염 색 하고, DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole)용액 으로지아디아 포낭의 핵을 염색 시킨 후 형광 DIC(Differential interference contrast)현미경으로 관찰하였다. 지아디아 포낭의 계수는 원생동물 표준시험방법에 의해 수행하였으며, DIC 관찰결과에 따라 다음과 같이 구분하여 계수하였다.
- DNA 에 대한 PCR 및 RNA 에 대한 RT-PCR 증폭으로부터 생산된 112bp의 PCR 증폭산물을 0.5 ug/mL의 ethidium bromide가 포함된 2% agarose gel에 전기영동하였으며, 결과 판독이 어려운 시료의 경우 0.5 #/mL의 ethidium bro- mide가 포함된 2% metaphor agarose gel에 전기영동하여 UV 하에서 확인하였다.
- IFA에 의한 결과값은 속빈 포낭, 무정형의 구조를 가진 포낭, 내부구조를 가진 포낭이 모두 포함된 총포낭수와 이 총포낭수에서 속빈포낭을 제외한 포낭수를 함께 기록하였으며, PCR 및 RT-PCR 결과와 비교할 때의 IFA 결과값은 속빈 포낭의 경우 포낭 내부에 DNA 또는 RNA를 포함하지 않기 때문에 총포낭수에서 속빈포낭을 제외한 포낭수를 사용하여 비교하였다.
- L,forward primer 및 reverse primer(Table 1) 각 1 pL 씩을 가한 것을 PCR증폭 반응액으로 사용하였다. PCR 증폭시마다 DNA 추출물 대신 멸균 정제수 23 uL를 첨가한 반응액을 같이 증폭하여 PCR 처리과정 증의 오염 발생여부를 관찰하였으며, 모든 용액, DNA 시료 및 정제수를 분취할 때 발생되는 오염을 방지하기 위해 PCR 실험용의 필터 팁을 사용하였다. PCR 증폭조건은 Table 2와 같다.
- RNA PCR 키트(One Step RNA PCR kit, Takara) 를 사용하여 역전사와 PCR과정을 동시에 수행하였으며 RNA 추출물 25 pL, 25 mM MgCl2 10 gL, 10X RNA PCR buffer 5 μL, 10 mM dNTP 5 μL, RNase inhibitor(40 units/gL) 1 HL, RTase(5units/μL) 1 pL, Taq polymerase(5 units/pL) 1 HL 및 Table 1에 나타낸 1차 프라이머 각 1 #씩을 첨가하여 반응액으로 사용하였고, 매 번의 RT-PCR 마다 RNA 추출물 대신 DEPC 처리된 멸균 정제수 25 #를 첨가한 반응액을 함께 증폭하여 DNA 및 RNA에 의한 오염발생 여부를 확인하였으며, 모든 용액, RNA 시료 및 정제수를 분취할때 발생되는 오염을 방지하기 위해 PCR 실험용의 필터 팁을 사용하였다. Nested PCRe 2.
- RNA 추출 과정에서의 모든 시약 및 초자는 RNase-free 제품으로 구매하거나 DEPC(Diethyl pyrocarbonate)로 처리하여 사용하였다. IMS 정제액 또는 살아있는 지아디아 포낭 부유액을 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 최종 약 10 HL로 농축하였다.
- 5절에 따라 RNA/DNA 추출부터 RT-PCR/PCR 증폭까지 수행하였다. 모든 시험은 2회 수행하였으며, 그 결과 1 포낭까지 증폭산물을 생산하였다(Fig. 2, Fig. 3, Table 4).
- 추출한 후 원심분리하여 재농축하였다. 이 농축액에 대해 면역자기분리 (Immunomagnetic separation ; IMS)과정을 수행하여 다른 방해물질로부터 지아디아를 분리하여 정제하였다.
- 지아디아 100, 50, 10, 1 포낭을 DEPC처리된 멸균 PBS (Phosphate Buffered Saline) 1 mil] 부유시킨 후 2.3 절 및 2.5절에 따라 RNA/DNA 추출부터 RT-PCR/PCR 증폭까지 수행하였다. 모든 시험은 2회 수행하였으며, 그 결과 1 포낭까지 증폭산물을 생산하였다(Fig.
- 1). 채취된 시료를 냉장 상태로 실험실에 운반하여 원생동물 표준시험 방법에 따라 여과(공경 1 gm Envirochek capsule filter, Gelman) 한 후 추출 및 농축하고, 면역자기분리키트(Dynabeads GC- Combo kit, Dynal Biote사!)를 사용하여 분리한 정제액을 PCR 및 RT-PCR 시험용 시료로 사용하였다. 방법을 요약하면, 지표수 시료를 채취하여 캡슐필터로 여과하고, 캡슐필터용 추출용액을 사용하여 진탕 .
- 하천수 시료 48점에 대해 살아있는 G. lamblia 동정을 위해 RT-PCR을 적용하였다. 채취된 하천수 시료 48개 증 10개 시료가 RT-PCR 양성으로, 21%가 살아있는 G.
대상 데이터
- 포르말린 처리되지 않은 살아있는 상태의 Giardia lamblia cysts(H3 isolate, Waterborne INC.)를 구매하여 단계별로 희석하여 정제일로부터 6주 이내의 것을 본 연구에 사용하였다.
- 한강수계 팔당 1지점 및 팔당 하류 2지점 그리고 한강으로 유입되는 대표적인 지류천 1지점에서 2005년 2월부터 2006년 12월까지 매월 채취하였으며, 2007년 1월에 추가로 1회 채취하여 1년간의 분포를 보고자 하였다(Fig. 1). 채취된 시료를 냉장 상태로 실험실에 운반하여 원생동물 표준시험 방법에 따라 여과(공경 1 gm Envirochek capsule filter, Gelman) 한 후 추출 및 농축하고, 면역자기분리키트(Dynabeads GC- Combo kit, Dynal Biote사!)를 사용하여 분리한 정제액을 PCR 및 RT-PCR 시험용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- #a에 특이적인 것으로 알려져 있다.0 DNA 증폭은 nested PCR기법을 사용하여 2단계로 증폭하였다. 1차 PCR 증폭은 시판되는 PCR premix(One Shot LA PCR mix, Takara) 25 μL, DNA 추출물 23 p.
- 2절에서 얻어진 IMS 정제액의 일부를 슬라이드 글라스 위에 적용하여 지아디아 항체가 표지된 면역형광항체 염색액(Merifluor Cryptosporidium / Giardia, Meridian Bioscience) 으로 염 색 하고, DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole)용액 으로지아디아 포낭의 핵을 염색 시킨 후 형광 DIC(Differential interference contrast)현미경으로 관찰하였다. 지아디아 포낭의 계수는 원생동물 표준시험방법에 의해 수행하였으며, DIC 관찰결과에 따라 다음과 같이 구분하여 계수하였다.
성능/효과
- 48개 하천수 시료의 지아디아 총포낭수의 평균 농도는 6.3 cysts/10 L(범위 : 0~54 cysts/10 L)이었고, 양성율은 62.5% (30/48)였으며, 속빈 포낭을 제외한 지아디아의 평균 농도는 4.5 cysts/10L(범위 : 0~45 cysts/10 L)이었고, 양성율은 52.1% (25/48)이었다.
- 그리고 12개 지류천수의 지아디아 총포낭수는 평균 21.8 cysts/10 L(3~54), 양성율은 100%였고, 속빈 포낭을 제외한지 아디아 포낭은 평균 16.6 cysts/10 L(1 ~45)이었고, 양성율은 100%를 나타내었다.
- 또한 36개 한강 본류의 지아디아 총포낭수는 1.1 cysts/10 L(0~6)이었고, 양성율은 50.0%(18/36)이었으며, 속빈 포낭을 제외한 지아디아 포낭은 평균 0.5 cysts/10 L(0~4), 양성율은 36.1%(13/36)이었다.
- 3%(12/36), 지류천 시료는 100%(12/12)의 양성율을 나타내었다. 또한 IFA 양성(속빈 포낭 제외)이면서 PCR 양성인 시료는 23개였고, IFA 음성이면서 PCR 음성인 시료는 20개로 시험된 시료의 89.6%(43/48)에서 현미경 관찰 결과와 PCR 결과가 일치하였다(Fig. 4).
- 또한 PCR 양성시료(24개) 중에서는 43.5%가 살아있는 G. lamblia를 포함하고 있는 것으로 나타났으며, 이때 IFA에서는 0~45 cysts/10 L(속빈 포낭 제외)이 관찰된 바, 본 연구에서 사용된 방법이 2 포낭 미만의 시료에도 적용가능한 매우 민감한 방법임이 확인되었다.
- lamblia가 확인되어 상수원 관리에서 유입지천의 중요성을 시사하였다. 또한 우리 나라 표준시험 방법 인 면역 형 광항체 에 의해 지 아디 아가 발견된 한강 본류 시료의 절반 이상이 G. lamblia를 함유하고, 대략 20% 정도가 살아있는 G. lamblia를 포함하였으며 표준시험 방법에 의해 지아디아가 발견된 지천 시료의 50%가 살아있는 G. lambliae: 함유하고 있음을 확인하여 PCR 및 RT-PCR을 이용해 표준시험방법을 보완하는 추가 정보를 얻을 수 있었다.
- lam#ia를 함유하고 있어, 정수처리시 이들의 불활성화 또는 제거에 유의해야 할 것으로 나타났다. 또한 유입지천은 약 50%가 살아있는 G. lamblia를 함유해 상수원관리 시 유입지천의 관리가 중요함을 시사하였다.
- Zam#ia에 대하여 PCR 및 RT-PCR을 수행한 결과 1 포낭까지 검출이 가능하였다. 또한 저농도의 지아디아 포낭을 포함하고 있는 하천수 시료에 적용한 결과, 89.6% 시료에서 현미경 관찰법인 IFA 결과와 PCR 결과가 일치하였으며, 현미경 관찰시 2 포낭 미만이 발견된 시료에서도 사람 감염성 종인 G. lamblia 는 물론 살아있는 G. lamblia 양성인 경우가 발견되어 본 연구에서 사용된 방법의 높은 민감도를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사용된 분석방법은 공중보건학적으로 보다 의미있는 데이터를 제공하는데 적용될 수 있다고 판단되며, 특히 건강에 보다 직접적인 영향을 미치는 수돗물, 지하수 등의 먹는물에 적용할 경우 검출된 지아디아 포낭의 사람 감염가능성 종의 여부 및 생사여부에 대한 정보를 줄 수있으므로 대응방안 마련에도 활용 가능할 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 Giardin primer를 이용하여 G. Zam#ia에 대하여 PCR 및 RT-PCR을 수행한 결과 1 포낭까지 검출이 가능하였다. 또한 저농도의 지아디아 포낭을 포함하고 있는 하천수 시료에 적용한 결과, 89.
- 유입지천의 경우에는 모든 시료에서 지아디아 포낭이 관찰되었는데 PCR에 의해서도 모두 양성으로 결과되어 모든 시료가 연중 G. lamblia를 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 5). 이러한 결과에 기초할 때, 한강 본류의 약 11%가 살아있는 G. lam#ia를 함유하고 있어, 정수처리시 이들의 불활성화 또는 제거에 유의해야 할 것으로 나타났다. 또한 유입지천은 약 50%가 살아있는 G.
- 조사된 한강 본류 시료의 50%에서 지아디아가 검출되었으며, 33% 시료가 G. lam#ia를 함유하고 11% 시료가 살아있는 G. lam#ia를 함유하고 있는 것으로 결과되었다. 특히 지천의 경우, 조사시료 모두에서 지아디아 및 G.
- 지천의 경우에는 모든 시료에서 IFA에 의해 지아디아가 관찰되었으며, RT-PCR에서는 이 중 50%(6/12)가 양성으로 나타나 연간 50%의 시료가 살아있는 G. lamblia를 함유하고 있는 것으로 추정된다.
- lamblia 동정을 위해 RT-PCR을 적용하였다. 채취된 하천수 시료 48개 증 10개 시료가 RT-PCR 양성으로, 21%가 살아있는 G. lam#ia를 포함하고 있는 것으로 나타났으며, 이 가운데 한강본류 3지점은 11%(4/36), 지류천수는 50%(6/12)의 양성율을 나타내었다 (Fig. 5). 이러한 결과에 기초할 때, 한강 본류의 약 11%가 살아있는 G.
- 총 포낭수에 대한 속빈 포낭을 제외한 포낭수의 비율이 한강본류는 45%, 지류천수는 76%로 지류천수가 유전정보를 가지고 있을 가능성이 많은 지아디아 포낭을 더 많이 포함하고 있는 것으로 나타났으며, 양성율 또한 한강본류보다 2.8배(속빈 포낭을 제외한 포낭수 기준) 높아 PCR 검출율이 더 높을 것으로 예상되었다.
- lam#ia를 함유하고 있는 것으로 결과되었다. 특히 지천의 경우, 조사시료 모두에서 지아디아 및 G. lambliaV} 확인되었으며, 50%의 시료에서 살아있는 G. lamblia가 확인되어 상수원 관리에서 유입지천의 중요성을 시사하였다. 또한 우리 나라 표준시험 방법 인 면역 형 광항체 에 의해 지 아디 아가 발견된 한강 본류 시료의 절반 이상이 G.
- 하천수 시료 48점에 대해 G. lamblia 동정을 위해 PCR을 적용한 결과, 전체 양성율은 50%(24/48)이었고, 이 가운데 한강본류 시료는 33.3%(12/36), 지류천 시료는 100%(12/12)의 양성율을 나타내었다. 또한 IFA 양성(속빈 포낭 제외)이면서 PCR 양성인 시료는 23개였고, IFA 음성이면서 PCR 음성인 시료는 20개로 시험된 시료의 89.
- 한강 본류의 경우 IFA에 의해 지아디아가 관찰된 시료의 17%(3/18)가 살아있는 G. lambliae: 함유한 것으로 나타났으며, 속빈 포낭을 제외할 경우 23%(3/13)가 활성을 가진 G. lamblia를 함유한 것으로 결과되어, 표준시험방법에 의해 지아디아가 발견된 시료의 대략 20% 정도가 살아있는 G. lam- blia일 것으로 추정된다.
- 한강본류 3지점에 대한 조사 결과, IFA에 의해 지아디아 포낭이 관찰된 시료의 50%(9/18)가 G. lam#ia를 함유한 것으로 나타났으며, 속빈 포낭을 제외할 경우 69%(9/13)가 G. lamblia 양성으로 결과되어 표준시험방법에 의해 지아디아가 발견된 시료의 절반 이상이 G. lamblia를 함유한 것으로 추정되었다.
후속연구
- 이하 IFA)이 적용되어 왔다. 그러나 이 방법은 사람 감염성 종인 Giardia lamblia 만을 구분하여 검출할 수 없으며, 생존 여부를 알 수 없고, 관찰 슬라이드 내에 지아디아포낭 외에 방해물질이 많이 포함되어 있을 경우 발견되지 않을 수 있다는 한계점을 가지고 있다.21 반면 PCR기법의 경우 지아디아속 뿐만 아니라 종수준까지 동정이 가능하여 사람에게 감염성을 나타내는 G.
- lamblia 양성인 경우가 발견되어 본 연구에서 사용된 방법의 높은 민감도를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사용된 분석방법은 공중보건학적으로 보다 의미있는 데이터를 제공하는데 적용될 수 있다고 판단되며, 특히 건강에 보다 직접적인 영향을 미치는 수돗물, 지하수 등의 먹는물에 적용할 경우 검출된 지아디아 포낭의 사람 감염가능성 종의 여부 및 생사여부에 대한 정보를 줄 수있으므로 대응방안 마련에도 활용 가능할 것으로 판단된다.
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