반합성 cephalosporin은 가장 널리 사용되는 항생제로서 전 세계 시장에서 cephalosporin 항생제의 가치는 세계의 선도적인 치료제 중 5위를 차지하고 있다. 반합성 cephalosporin은 cephalosporin C의 화학적 탈아실화 반응에 의해 얻어지는 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA)를 원료로 합성되어 진다. 그러나 이러한 화학적 방법에 의한 생산에는 값비싼 단계가 많이 포함되어 있으며 화학폐기물의 완전한 처리가 요구되어진다. 그러므로 효소에 의한 CPC에서 7-ACA로의 변환은 cephalosporin 항생제 제조에 있어서 매우 흥미 있는 일이다. 효소공정에 의한 7-ACA의 생산을 산업적으로 적용할 때에 cephalosporin acylase(...
반합성 cephalosporin은 가장 널리 사용되는 항생제로서 전 세계 시장에서 cephalosporin 항생제의 가치는 세계의 선도적인 치료제 중 5위를 차지하고 있다. 반합성 cephalosporin은 cephalosporin C의 화학적 탈아실화 반응에 의해 얻어지는 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA)를 원료로 합성되어 진다. 그러나 이러한 화학적 방법에 의한 생산에는 값비싼 단계가 많이 포함되어 있으며 화학폐기물의 완전한 처리가 요구되어진다. 그러므로 효소에 의한 CPC에서 7-ACA로의 변환은 cephalosporin 항생제 제조에 있어서 매우 흥미 있는 일이다. 효소공정에 의한 7-ACA의 생산을 산업적으로 적용할 때에 cephalosporin acylase(CA)가 glutaryl-7-ACA(GL-7-ACA)를 주요 기질로 사용하며 CPC에 대해서는 너무 낮은 기질특이성을 지닌다는 큰 문제점이 있다. CPC에 대한 활성이 높은 CA를 얻기 위한 많은 노력들이 있었으나 아직까지 큰 성공을 거두지 못하였다. 이러한 활성증진 연구에는 CA의 3차원구조에 대한 정보가 없었기 때문에 CPC 활성 증진을 위한 CA의 연구에 있어서 두드러진 발전이 없었다.
그러나 최근 Pseudomonas diminuta로부터 생성되는 class I CA(CAD)의 구조가 2.0Å 분해능에서 결정되었다. 그뿐만 아니라 CA와 glutaryl-7-ACA(CA가 가장 선호하는 기질) 그리고 glutarate(GL-7-ACA의 side chain)와의 복합체 구조가 밝혀졌다. 이 구조 연구는 substrate binding site의 기질 특이성에 대해 이해하는데 도움을 주었으며 CPC에서 7-ACA로의 변환률이 증가된 효소의 디자인에도 큰 기여를 하였다.
본 연구에서는 CPC에 대한 높은 deacylation활성을 얻기 위해 CA의 active-site residues에 대해 site-directed mutagenesis를 수행하였으며 mutant design은 CAD의 ligand bound구조에 기초하였다.
Mutation은 기질(GL-7-ACA)과 상호 작용하는 CAD의 active-site residues에 초점을 맞췄으며 궁극적으로 CPC의 α-aminoadipyl기를 수용하기에 적합한 CAD를 만들어 CA에 의한 CPC에서 7-ACA로의 효소변환 공정을 확립하는데 목표를 두고 있다.
CAD의 active-site 내의 10개의 잔기에 대한 mutation을 통해 CPC에 대한 deacylation 활성을 측정하였으며 그중 Y33βS, Q50βM mutant들이 wild-type과 비교해 CPC에 대한 deacylation 활성이 120%, 180%로 증가하였다. 계속되는 2차 mutation 연구에서는 deacylation활성이 증가된 Q50βM을 template로 하여 α-aminoadipyl기와 충돌이 일어나는 active-site내의 Y33β, Y149α, F58β의 3개의 아미노산을 추가적으로 mutation 시켰으며 Y33βS와 Y33βG를 제외한 모든 double mutant들은 wild-type보다 높은 CPC 활성을 보였으며 그 중 Y149αK, Y33βD는 wild-type에 비해 CPC 활성이 600%, 450%로 가장 큰 증가를 보였다. CAD의 CPC에대한 deacylation활성을 보다 더 증가시키기 위해 계속적인 mutation을 통해 mutant CAD가 7-ACA의 산업적 생산에 적용될 수 있기를 희망한다.
반합성 cephalosporin은 가장 널리 사용되는 항생제로서 전 세계 시장에서 cephalosporin 항생제의 가치는 세계의 선도적인 치료제 중 5위를 차지하고 있다. 반합성 cephalosporin은 cephalosporin C의 화학적 탈아실화 반응에 의해 얻어지는 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA)를 원료로 합성되어 진다. 그러나 이러한 화학적 방법에 의한 생산에는 값비싼 단계가 많이 포함되어 있으며 화학폐기물의 완전한 처리가 요구되어진다. 그러므로 효소에 의한 CPC에서 7-ACA로의 변환은 cephalosporin 항생제 제조에 있어서 매우 흥미 있는 일이다. 효소공정에 의한 7-ACA의 생산을 산업적으로 적용할 때에 cephalosporin acylase(CA)가 glutaryl-7-ACA(GL-7-ACA)를 주요 기질로 사용하며 CPC에 대해서는 너무 낮은 기질특이성을 지닌다는 큰 문제점이 있다. CPC에 대한 활성이 높은 CA를 얻기 위한 많은 노력들이 있었으나 아직까지 큰 성공을 거두지 못하였다. 이러한 활성증진 연구에는 CA의 3차원구조에 대한 정보가 없었기 때문에 CPC 활성 증진을 위한 CA의 연구에 있어서 두드러진 발전이 없었다.
그러나 최근 Pseudomonas diminuta로부터 생성되는 class I CA(CAD)의 구조가 2.0Å 분해능에서 결정되었다. 그뿐만 아니라 CA와 glutaryl-7-ACA(CA가 가장 선호하는 기질) 그리고 glutarate(GL-7-ACA의 side chain)와의 복합체 구조가 밝혀졌다. 이 구조 연구는 substrate binding site의 기질 특이성에 대해 이해하는데 도움을 주었으며 CPC에서 7-ACA로의 변환률이 증가된 효소의 디자인에도 큰 기여를 하였다.
본 연구에서는 CPC에 대한 높은 deacylation활성을 얻기 위해 CA의 active-site residues에 대해 site-directed mutagenesis를 수행하였으며 mutant design은 CAD의 ligand bound구조에 기초하였다.
Mutation은 기질(GL-7-ACA)과 상호 작용하는 CAD의 active-site residues에 초점을 맞췄으며 궁극적으로 CPC의 α-aminoadipyl기를 수용하기에 적합한 CAD를 만들어 CA에 의한 CPC에서 7-ACA로의 효소변환 공정을 확립하는데 목표를 두고 있다.
CAD의 active-site 내의 10개의 잔기에 대한 mutation을 통해 CPC에 대한 deacylation 활성을 측정하였으며 그중 Y33βS, Q50βM mutant들이 wild-type과 비교해 CPC에 대한 deacylation 활성이 120%, 180%로 증가하였다. 계속되는 2차 mutation 연구에서는 deacylation활성이 증가된 Q50βM을 template로 하여 α-aminoadipyl기와 충돌이 일어나는 active-site내의 Y33β, Y149α, F58β의 3개의 아미노산을 추가적으로 mutation 시켰으며 Y33βS와 Y33βG를 제외한 모든 double mutant들은 wild-type보다 높은 CPC 활성을 보였으며 그 중 Y149αK, Y33βD는 wild-type에 비해 CPC 활성이 600%, 450%로 가장 큰 증가를 보였다. CAD의 CPC에대한 deacylation활성을 보다 더 증가시키기 위해 계속적인 mutation을 통해 mutant CAD가 7-ACA의 산업적 생산에 적용될 수 있기를 희망한다.
Semi-synthetic cephalosporins are the most widely used antibiotics and their total worldwide market value was ranked fifth among the leading therapeutic agents worldwide. Semi-synthetic cephalosporins are primary synthesized from 7-aminocephalosporanic acid(7-ACA) which is usually obtained by chemic...
Semi-synthetic cephalosporins are the most widely used antibiotics and their total worldwide market value was ranked fifth among the leading therapeutic agents worldwide. Semi-synthetic cephalosporins are primary synthesized from 7-aminocephalosporanic acid(7-ACA) which is usually obtained by chemical deacylation of cephalosporin C(CPC). The chemical production of 7-ACA includes, however, several expensive steps and requires the disposal of chemical wastes. Thus the enzymatic conversion of CPC to 7-ACA by cephalosporin acylase(CA) would be of great interest. However, CA uses glutaryl-7-aminocephalosporanic acid(glutaryl-7-ACA) as a primary substrate and has too low substrate specificity for CPC. Unsuccessful attempts to obtain a direct enzymatic transformation of CPC into 7-ACA by a single CA have led to the development of an inefficient 2-enzyme process using CA and D-amino acid oxidase(DAAO). The absence of three-dimensional structure for CAs has been a handicap for progress of protein engineering, but the structure of a class I CA from Pesudomonas diminuta(CAD) was recently determined at 2.0Å resolution. In addition, two binary structures in complex with GL-7-ACA(the most favored substrate) and glutarate(side-chain of GL-7-ACA0 were determined at 2.6 and 2.5Å resolutions, respectively. Those three structures revealed active-site conformation and detailed interactions of GL-7-ACA with residues in side-chain pocket of active-site
In the report, an attempt is carried out such that the active-site residues of CAD were mutagenized to introduce higher deacylation activity with regard to CPC. The design of mutations was guided by the ligand bound structures of CAD the residues. The mutations are focused on the active-site residues, which are interacting with substrate(GL-7-ACA), especially for residues forming the side-chain pocket for the purpose of generating a sterically favored conformation to accommodate the α-aminoadipyl moiety of CPC.
In order to confirm the effect of the ten residues in active-site on catalytic activity, the residues involved in substrate binding were mutagenized to different amino acids and their effects for catalysis with regard to GL-7-ACA and CPC were investigated by comparing the deacylation activity of mutant CADs with wild-type. Three mutants, such as Y33βS and Q50βM, improved deacylation activity to CPC 120 and 180% relative to wild type. Since the Q50βM provided a starting point to improve deacylation activity to CPC, we take the mutant to add subsequently site-directed mutation to further improve deacylation activity. In rotating the torsional angles of the modeled α-aminoadipyl moiety, it collides with neighboring residues such as Y33β, 149α and F58β in a chosen orientation. In order to generate space for the α-aminoadipyl moiety, the first set(Y33β, 149α, F58β) was mutagenized to any amino acids by saturation mutagenesis. All mutants except for Y33βS and Y33βG showed higher deacylation to CPC than wide-type. Surprisingly, Y149αK and Y33βD showed greatest improvement in deacylation activity with regard to CPC as much as 600% and 450% of wide-type, respectively
This mutation studies shed a light for carrying out continuous research to improve deacylation activity to CPC by adopting repetitive saturation mutagenesis in side-chain pocket, hoping the mutant CA applicable to industrial application in single enzyme process of 7-ACA production.
Semi-synthetic cephalosporins are the most widely used antibiotics and their total worldwide market value was ranked fifth among the leading therapeutic agents worldwide. Semi-synthetic cephalosporins are primary synthesized from 7-aminocephalosporanic acid(7-ACA) which is usually obtained by chemical deacylation of cephalosporin C(CPC). The chemical production of 7-ACA includes, however, several expensive steps and requires the disposal of chemical wastes. Thus the enzymatic conversion of CPC to 7-ACA by cephalosporin acylase(CA) would be of great interest. However, CA uses glutaryl-7-aminocephalosporanic acid(glutaryl-7-ACA) as a primary substrate and has too low substrate specificity for CPC. Unsuccessful attempts to obtain a direct enzymatic transformation of CPC into 7-ACA by a single CA have led to the development of an inefficient 2-enzyme process using CA and D-amino acid oxidase(DAAO). The absence of three-dimensional structure for CAs has been a handicap for progress of protein engineering, but the structure of a class I CA from Pesudomonas diminuta(CAD) was recently determined at 2.0Å resolution. In addition, two binary structures in complex with GL-7-ACA(the most favored substrate) and glutarate(side-chain of GL-7-ACA0 were determined at 2.6 and 2.5Å resolutions, respectively. Those three structures revealed active-site conformation and detailed interactions of GL-7-ACA with residues in side-chain pocket of active-site
In the report, an attempt is carried out such that the active-site residues of CAD were mutagenized to introduce higher deacylation activity with regard to CPC. The design of mutations was guided by the ligand bound structures of CAD the residues. The mutations are focused on the active-site residues, which are interacting with substrate(GL-7-ACA), especially for residues forming the side-chain pocket for the purpose of generating a sterically favored conformation to accommodate the α-aminoadipyl moiety of CPC.
In order to confirm the effect of the ten residues in active-site on catalytic activity, the residues involved in substrate binding were mutagenized to different amino acids and their effects for catalysis with regard to GL-7-ACA and CPC were investigated by comparing the deacylation activity of mutant CADs with wild-type. Three mutants, such as Y33βS and Q50βM, improved deacylation activity to CPC 120 and 180% relative to wild type. Since the Q50βM provided a starting point to improve deacylation activity to CPC, we take the mutant to add subsequently site-directed mutation to further improve deacylation activity. In rotating the torsional angles of the modeled α-aminoadipyl moiety, it collides with neighboring residues such as Y33β, 149α and F58β in a chosen orientation. In order to generate space for the α-aminoadipyl moiety, the first set(Y33β, 149α, F58β) was mutagenized to any amino acids by saturation mutagenesis. All mutants except for Y33βS and Y33βG showed higher deacylation to CPC than wide-type. Surprisingly, Y149αK and Y33βD showed greatest improvement in deacylation activity with regard to CPC as much as 600% and 450% of wide-type, respectively
This mutation studies shed a light for carrying out continuous research to improve deacylation activity to CPC by adopting repetitive saturation mutagenesis in side-chain pocket, hoping the mutant CA applicable to industrial application in single enzyme process of 7-ACA production.
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