재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 전달체 (recombinant adeno-assicated virus; rAAV)는 세포 또는 조직에 전달한 유전자의 발현을 장기적으로 유도한다. 또한 신경 및 근육 세포와 조직에 대한 우수한 유전자 전달 효과와 면역 반응의 최소화 등의 장점을 가지고 있다. 그러나 rAAV의 형질 전환율은 아직도 유전자 발현에 따른 효능을 기대하기에는 아직 미흡한 점이 많이 있다. 따라서 본 연구는 이러한 rAAV의 낮은 유전자 형질 도입율을 개선하기 위하여 각종 화학물(chemical)을 첨가함으로써 유전자 발현율의 증대를 유도하고자 하였다. 각종 인체 암세포주를 대상으로 rAAV ...
재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 전달체 (recombinant adeno-assicated virus; rAAV)는 세포 또는 조직에 전달한 유전자의 발현을 장기적으로 유도한다. 또한 신경 및 근육 세포와 조직에 대한 우수한 유전자 전달 효과와 면역 반응의 최소화 등의 장점을 가지고 있다. 그러나 rAAV의 형질 전환율은 아직도 유전자 발현에 따른 효능을 기대하기에는 아직 미흡한 점이 많이 있다. 따라서 본 연구는 이러한 rAAV의 낮은 유전자 형질 도입율을 개선하기 위하여 각종 화학물(chemical)을 첨가함으로써 유전자 발현율의 증대를 유도하고자 하였다. 각종 인체 암세포주를 대상으로 rAAV 수용체 (receptor) 발현을 증가시키는 trichostatin A, DNA 합성 억제제인 aphidicolin 과 hydroxyurea, topoisomerase 저해제인 etoposide와 camptothecin, proteosome 저해제인 MG-132, 그리고 epidermal growth factor receptor (EGFP) 억제제인 tyrphostin-1을 적용하여 유전자 전달 효율성의 증대 유무를 검증하였다. LacZ를 표지 유전자로 하고 x-gal 염색법을 시행하여 분석한 결과, 본 연구에 사용한 rAAV에 의한 유전자 전달 효율은 약 0.02% 정도로 매우 낮았다. 하지만 hydroxyurea를 전처리 한 후의 효율은 자궁암세포 주 Hela, 직장암 세포 주 HCT 116에서 각각 25배, 5배, 간암 세포 주 SK-Hep1에서는 MG-132 처리시8.5배 형질 전환 효율을 보였다. 각각의 chemical을 동시 처리 (chemical combination) 하였을 때 Hela와 MCF-7에서 combined effect를 관찰할 수 있었다. Hela의 경우 camptothecin (1.5배) 과 MG-132 (8.5배) 를 동시에 처리하였을 때 12배까지 유전자 감염 효율이 증가함을 확인하였다. 또한 동일한 세포주에 hydroxyurea (1.3배) 와 tyrphostin-1 (3배) 를 동시 처리한 경우8배까지 각 chemical combination 효과를 확인할 수 있었다. 또한MCF-7에서도 hydroxyurea (8배) 와 tyrphostin-1 (3배) 을 공동 처리 하였을 때 12배까지 유전자 전달 효율이 상승함을 알 수 있었다. 하지만, HCT 116과 SK-Hep 1 의 경우에는 화학물의 동시 처리에 따른 유전자 전달 효율성 증대를 관찰할 수 없었다. 마지막으로, 상기 화학물들은 고농도에서 처리시 세포에 손상을 줄 수도 있으나 본 연구에 사용된 농도에서는 동시처리의 경우에도 세포에 손상을 주지 않음을 MTT assay로 확인하였다. 따라서 본 연구 결과로rAAV에 의한 유전자 전달 효율은 대상 인체 암 세포주의 종류에 따라 또한 처리한 chemical의 종류와 작용 기작의 특성에 따라 반응도에 차이가 있음을 확인하였다. 하지만 rAAV의 유전자 형질 도입율은 각종 화합물의 첨가 특히 서로 다른 성질을 가진 화합물의 동시 처리에 의하여 상당부분 개선되어질 수 있음을 관찰하였다. 이러한 chemical에 의한 rAAV유전자 전달 효율 증대 효과가 인체 종양 세포주뿐 아니라 신경 세포주 등에서도 유도될 수 있다면, rAAV의 취약점을 크게 보완해 주는 것으로 그 유용성이 매우 클 것으로 기대된다.
재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 전달체 (recombinant adeno-assicated virus; rAAV)는 세포 또는 조직에 전달한 유전자의 발현을 장기적으로 유도한다. 또한 신경 및 근육 세포와 조직에 대한 우수한 유전자 전달 효과와 면역 반응의 최소화 등의 장점을 가지고 있다. 그러나 rAAV의 형질 전환율은 아직도 유전자 발현에 따른 효능을 기대하기에는 아직 미흡한 점이 많이 있다. 따라서 본 연구는 이러한 rAAV의 낮은 유전자 형질 도입율을 개선하기 위하여 각종 화학물(chemical)을 첨가함으로써 유전자 발현율의 증대를 유도하고자 하였다. 각종 인체 암세포주를 대상으로 rAAV 수용체 (receptor) 발현을 증가시키는 trichostatin A, DNA 합성 억제제인 aphidicolin 과 hydroxyurea, topoisomerase 저해제인 etoposide와 camptothecin, proteosome 저해제인 MG-132, 그리고 epidermal growth factor receptor (EGFP) 억제제인 tyrphostin-1을 적용하여 유전자 전달 효율성의 증대 유무를 검증하였다. LacZ를 표지 유전자로 하고 x-gal 염색법을 시행하여 분석한 결과, 본 연구에 사용한 rAAV에 의한 유전자 전달 효율은 약 0.02% 정도로 매우 낮았다. 하지만 hydroxyurea를 전처리 한 후의 효율은 자궁암 세포 주 Hela, 직장암 세포 주 HCT 116에서 각각 25배, 5배, 간암 세포 주 SK-Hep1에서는 MG-132 처리시8.5배 형질 전환 효율을 보였다. 각각의 chemical을 동시 처리 (chemical combination) 하였을 때 Hela와 MCF-7에서 combined effect를 관찰할 수 있었다. Hela의 경우 camptothecin (1.5배) 과 MG-132 (8.5배) 를 동시에 처리하였을 때 12배까지 유전자 감염 효율이 증가함을 확인하였다. 또한 동일한 세포주에 hydroxyurea (1.3배) 와 tyrphostin-1 (3배) 를 동시 처리한 경우8배까지 각 chemical combination 효과를 확인할 수 있었다. 또한MCF-7에서도 hydroxyurea (8배) 와 tyrphostin-1 (3배) 을 공동 처리 하였을 때 12배까지 유전자 전달 효율이 상승함을 알 수 있었다. 하지만, HCT 116과 SK-Hep 1 의 경우에는 화학물의 동시 처리에 따른 유전자 전달 효율성 증대를 관찰할 수 없었다. 마지막으로, 상기 화학물들은 고농도에서 처리시 세포에 손상을 줄 수도 있으나 본 연구에 사용된 농도에서는 동시처리의 경우에도 세포에 손상을 주지 않음을 MTT assay로 확인하였다. 따라서 본 연구 결과로rAAV에 의한 유전자 전달 효율은 대상 인체 암 세포주의 종류에 따라 또한 처리한 chemical의 종류와 작용 기작의 특성에 따라 반응도에 차이가 있음을 확인하였다. 하지만 rAAV의 유전자 형질 도입율은 각종 화합물의 첨가 특히 서로 다른 성질을 가진 화합물의 동시 처리에 의하여 상당부분 개선되어질 수 있음을 관찰하였다. 이러한 chemical에 의한 rAAV유전자 전달 효율 증대 효과가 인체 종양 세포주뿐 아니라 신경 세포주 등에서도 유도될 수 있다면, rAAV의 취약점을 크게 보완해 주는 것으로 그 유용성이 매우 클 것으로 기대된다.
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) has been recently drawn an attention as a gene delivery system with the advantage of long-term and efficient gene expression in various cell types, especially neuronal and muscle cells. However, transduction efficiency by rAAV is still low, which may explain...
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) has been recently drawn an attention as a gene delivery system with the advantage of long-term and efficient gene expression in various cell types, especially neuronal and muscle cells. However, transduction efficiency by rAAV is still low, which may explain its limited application, even in neuronal cells in vitro. To overcome this drawback of rAAV system, I have tried to enhance the transduction efficacy using many different kinds of chemicals which can have an effect on DNA synthesis, cell cycle or rAAV receptor expression. To elucidate the enhanced transduction efficacy, I investigated the enhanced transduction efficacy of rAAV expression by treatment or combination of seven chemicals (Trichostatin A as an inducer of rAAV receptor expression, Aphidicolin and Hydroxyurea as a DNA damaging agent, Etopocide and Camptothecin as a DNA synthesis blocker, MG-132 as a proteosome inhibitor, and Tyrphostin-1 as a EGFR inhibitor) in five different human cancer cell lines (cervical Hela, colon HCT 116, breast MCF-7, hepatocellular carcinoma SK-Hep 1, and glioma U 251). Hydorxyurea increased the transduction efficiency by 25- or 5-fold in Hela or HCT 116 cells, respectively. MG-132 increased the transduction efficiency by 8.5-fold in SK-Hep 1 cells. Co-treatment of MG-132 and camptothecin enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela cells. The combined treatment of hydroxyurea and tyrphostin-1 also enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela cells. Finally, MTT assay data consistently showed that cytotoxicity was not observed in any concentrations of each chemical used in this study. In conclusion, the transduction efficiency of rAAV mediated transgene expression could be significantly enhanced in human cancer cells by chemical combinations. This may be of wide application to other cells, such as primary neuronal cells, neural progenitor cells as an optimized gene delivery condition with highly improved transduction efficiency.
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) has been recently drawn an attention as a gene delivery system with the advantage of long-term and efficient gene expression in various cell types, especially neuronal and muscle cells. However, transduction efficiency by rAAV is still low, which may explain its limited application, even in neuronal cells in vitro. To overcome this drawback of rAAV system, I have tried to enhance the transduction efficacy using many different kinds of chemicals which can have an effect on DNA synthesis, cell cycle or rAAV receptor expression. To elucidate the enhanced transduction efficacy, I investigated the enhanced transduction efficacy of rAAV expression by treatment or combination of seven chemicals (Trichostatin A as an inducer of rAAV receptor expression, Aphidicolin and Hydroxyurea as a DNA damaging agent, Etopocide and Camptothecin as a DNA synthesis blocker, MG-132 as a proteosome inhibitor, and Tyrphostin-1 as a EGFR inhibitor) in five different human cancer cell lines (cervical Hela, colon HCT 116, breast MCF-7, hepatocellular carcinoma SK-Hep 1, and glioma U 251). Hydorxyurea increased the transduction efficiency by 25- or 5-fold in Hela or HCT 116 cells, respectively. MG-132 increased the transduction efficiency by 8.5-fold in SK-Hep 1 cells. Co-treatment of MG-132 and camptothecin enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela cells. The combined treatment of hydroxyurea and tyrphostin-1 also enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela cells. Finally, MTT assay data consistently showed that cytotoxicity was not observed in any concentrations of each chemical used in this study. In conclusion, the transduction efficiency of rAAV mediated transgene expression could be significantly enhanced in human cancer cells by chemical combinations. This may be of wide application to other cells, such as primary neuronal cells, neural progenitor cells as an optimized gene delivery condition with highly improved transduction efficiency.
Keyword
#재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 형질 도입율 Recombinant adeno-associated virus(rAAV) Transduction efficiency Chemical combination Camptothecin Hydroxyurea Tyrphostin-1 MG-132
학위논문 정보
저자
김성진
학위수여기관
연세대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
의과학과
지도교수
장진우
발행연도
2003
총페이지
iv, 46p.
키워드
재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 형질 도입율 Recombinant adeno-associated virus(rAAV) Transduction efficiency Chemical combination Camptothecin Hydroxyurea Tyrphostin-1 MG-132
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