초록 ▼

아데노바이러스는 생체내 유전자 전달 효율이 우수하여 암치료용 벡터로 대두되고 있으나 임상시험결과 인체의 종양조직에는 아데노바이러스의세포수용체인 CAR의 발현이 낮아 암세포로의 유전자 전달 효율이 낮다는 문제점이 제기되었다. 따라서 본 연구에서는 암세포로의 아데노바이러스의 감염효율을 증대시키기 위한 방안으로, 인체 세포주의 세포막에 다량으로 발현되어 있는 phosphatidyl serine(PS)과 결합할 수 있는 VSV-G 막단백질의 epitope을 이용하여 암세포를 표적화하였다. 즉, 다양한 숙주세포로의 감염을 매개하는 VSV-G

아데노바이러스는 생체내 유전자 전달 효율이 우수하여 암치료용 벡터로 대두되고 있으나 임상시험결과 인체의 종양조직에는 아데노바이러스의세포수용체인 CAR의 발현이 낮아 암세포로의 유전자 전달 효율이 낮다는 문제점이 제기되었다. 따라서 본 연구에서는 암세포로의 아데노바이러스의 감염효율을 증대시키기 위한 방안으로, 인체 세포주의 세포막에 다량으로 발현되어 있는 phosphatidyl serine(PS)과 결합할 수 있는 VSV-G 막단백질의 epitope을 이용하여 암세포를 표적화하였다. 즉, 다양한 숙주세포로의 감염을 매개하는 VSV-G epitope을 아데노바이러스의 fiber 말단 부위에 삽입하여 CAR와의 결합능 이외에 세포막에 다량 발현되어 있는 PS를 통해서도 세포를 감염시킬 수 있는 아데노바이러스를 제작하였다. LacZ를 표지유전자로 발현하고 fiber 말단에 VSV-G epitope이 삽입된 복제 불능 아데노바이러스인 dl324-LacZ-VSVG의 경우, 야생형 filler를 가진 대조군 아데노바이러스인 dl324-LacZ 바이러스에 비해 유전자 형질 도입율이 현저히 증가하였으며, 특히 CAR의 발현이 매우 낮은 세포주들에서의 유전자 전달 효율이 약 20배 정도 증가함을 관찰하였다. 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능을 비교 검증할 수 있는 CRE assay와 MTT assay를 통하여, 대조군 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-1에 비해 YKC-VSVG 아데노바이러스에 의한 세포 살상능이 월등히 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 생체내 항종양 실험에서도 YKC-VSVG 아데노바이러스의 증가된 암세포 살상능이 확인되었다. 이러한 결과들은 본 연구에서 제작된 VSV-G epitope이 삽입된 아데노바이러스들이 CAR 수용체 뿐만 아니라 PS를 통해서도 세포를 감염함으로서 유전자 전달 효율과 세포 살상능이 증가될 수 있음을 의미한다. 세포살상을 유도할 수 있는 약제 감수성 유전자들인 HSV-1 thymdine kinase(TK)와 cytosine deaminase(CD)들을 도입한 YKC-VSVG-CDTK 아데노바이러스는, 여러 종류의 암세포주들에서, 바이러스 자체에 의한 세포 살상능 뿐만 아니라 TK 발현에 의한 세포살상을 함께 유도하여 증폭된 세포살상능을 나타내었다. 또한, CD의 prodrug인 5-FC를 TK의 prodrug인 GCV와 함께 처리하였을 때 prodrug을 각각 처리한 경우보다 세포 살상능이 횔씬 상승적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 본 연구에서 개발된 YKC-VSVG-CDTK 아데노바이러스는 바이러스의 증식에 의한 세포살상과 더불어 prod겨g에 의한 암세포 살상을 함께 유도하여 암세포 살상능이 배가되었을 뿐아니라, 아데노바이러스 fiber 말단에 삽입된 VSV-Gl epitop으로 인하여 기존의 아데노바이러스로 감염이 잘 되지 않는 여러 다양한 암세포로의 감염이 가능하게 되어, 임상에서 문제가 되고 있는 여러 가지 사람 종양 세포에서의 CAR의 결손이나 미미한 발현으로 생기는 낮은 유전자 형질 도입효율을 극복할 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Recombinant adenovirus have become the choice of vector system for cancer gene therapy. However, the utility of adenoviral vectors has been limited due to the low efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to cancer cells, which express low level of CAR on their surface. By developing strategie

Recombinant adenovirus have become the choice of vector system for cancer gene therapy. However, the utility of adenoviral vectors has been limited due to the low efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to cancer cells, which express low level of CAR on their surface. By developing strategies to achieve adenovirus infection via alternate receptor pathway, enhanced and more specific gene delivery can be achieved. To increase the efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to cancer cells, we generated novel recombinant adenoviruses, dl-VSVG-LacZ and YKC-VSVG, which contain a fiber knob with intact CAR-entry capability and an additional PS-entry capability by incorporating the VSV-G epitope onto the C-terminus of the fiber knob. VSV-G is an envelop protein of Vesicular Stomatitis Virus (VSV) that facilitates the specificity for the binding of the virus to a PS-moiety on the cellular plasma membrane. In this study, we show that dl-VSVG-LacZ substantially increased the gene transfer efficiency in a variety of cancer cells including CAR-deficient cells. The largest improvement of gene transfer was observed for the cells that were difficult to transduce with untargeted adenoviruses. In addition, we demonstrate that the oncolytic potential of YKC-VSVG was greatly improved by enhanced infectivity. Furthermore, treatment with YKC-VSVG significantly suppressed tumor growth in xenograft tumor model when compared with control adenovirus that lacks VSV-G epitope. To combine the advantages of the prodrug/suicide gene approach with that of replicating adenovirus, we have developed replicating adenoviral vector harboring CD and TK, generating YKC-VSVG-CDTK. Infection with YKC-VSVG-CDTK increased the sensitivity of cells to GCV in a dose-dependent manner. Additionally, cytotoxicity in the presence of both GCV and 5-FC was greater than that after single prodrug treatments, indicating additive effects of the prodrug treatments. Furthermore, inoculation of the animals with the replication-competent adenovirus with GCV was more efficacious than either the replication-incompetent adenovirus with GCV or replication-competent adenovirus alone. Taken together, these studies demonstrate that the strategy to extend adenovirus tropism may greatly improve utilities of adenovirus for gene therapy application. In addition, this dual strategy using CD and TK as suicide genes is more efficacious than each component individually.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과 요약문...4
• (한글) 유전자 전달 효율 및 암세포 살상능이 개선된 차세대 아데노바이러스 벡터의 개발...4
• (영문) Development of advanced adenoviral vector with augmented gene transfer efficiency and potential oncolytic activity...5
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• (1) 최종 연구목표...6
• (2) 연차별 연구목표...6
• (3) 연차별 연구개발 추진계획...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...9
• (1) VSV-G epitope을 아데노바이러스의 fiber 말단에 삽입시킨 아데노바이러스 셔틀벡터의 제작...9
• (2) 셔틀벡터 pSK[+103bp]와 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-1과의 상동 재조합으로 VSV-G epitope을 지니는 재조합 아데노바이러스 YKC-VSVG의 제작...11
• (3) 표지 유전자로 LacZ를 지니는 d1324-VSVG-LacZ 바이러스의 제작과 유전자 형질 도입 효율에 대한 연구...12
• (4) YKC-VSVG의 증가된 종양세포 특이적 살상 능력의 규명...15
• (5) 유전자 형질 도입율과 phosphatidyl serine 함량과의 관계에 대한 연구...17
• (6) 누드마우스 종양 모델(in vivo)에 있어서의 d1324-VSVG-LacZ 바이러스에 의한 유전자형질 도입 효율에 관한 연구...17
• (7) YKC-VSVG에 의한 항종양 효과의 검증...19
• (8) YKC-VSVG-CDTK 바이러스의 제작...20
• (9) 여러 암세포주들에서 YKC-VSVG-CDTK 바이러스에 의한 암세포 살상 효과의 검증...23
• (10) YKC-VSVG-CDTK 바이러스에 의한 생체내 항종양 효과의 검증...25
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...27
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...31
• (1) 학술지 게재...31
• (2) 학회 발표...31
• (3) 학위논문...32
• (4) 산업 재산권...32
• (6) 총괄연구개발과제의 목표달성도...33
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...34
• (1) 연구종료 2년후 예상 연구성과...34
• (2) 연구성과의 활용계획...34
• 6. 첨부서류...36
• 7. 참고문헌...37