순환계의 질환은 대부분 혈전에 기인하는데 이 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병이나 혈전증이라고 한다. 이러한 순환계 질환들을 치료하기 위한 혈전 용해에 관한 연구가 최근에는 발효식품인 젓갈, 된장, 청국장 등에서 안전한 혈전용해제를 찾고 있다. 본 연구는 그 연장선상의 연구로서 치마버섯(Schizophyllum commune W130)의 균사체를 액체 배양하여 배양액으로부터 분비성 혈전용해효소를 확인하였다. 따라서 혈전용해효소 생산을 위한 최적조건의 검토와 혈전용해효소의 정제 및 그 특성을 규명하여 효소의 안정성을 검토한 후 식품으로서의 이용 이외에도 균사체 배양에 의한 혈전용해효소의 대량생산에 의해 의약품으로서 응용하기 위한 목적이 있다. 치마버섯을 이용한 혈전용해효소 생산최적조건을 검토한 결과 1.5% cornsteep liquor, 2% dextrose, 1.0% soytone, 그리고 initial pH6.0에서 배양온도는 25℃였다. 이러한 조건을 이용하여 150 ml/300 ml flask를 이용하여 배양한 결과 혈전용해효소는 균체 내보다 균체 외에서 약 6배나 많은 것으로 보아 본 버섯 균사체는 효소 분비력이 강한 것으로 나타났다. 균사체를 최적 배양생산 조건에서 접종하여 25℃, 80 rpm으로 8일간 배양한 후 원심 분리하여 균사체를 완전히 제거시키고 상등액만을 조효소액으로 사용하였다. DEAE Sephadex A-50 ion exchange column, Sephadex G-75 gel ...
순환계의 질환은 대부분 혈전에 기인하는데 이 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병이나 혈전증이라고 한다. 이러한 순환계 질환들을 치료하기 위한 혈전 용해에 관한 연구가 최근에는 발효식품인 젓갈, 된장, 청국장 등에서 안전한 혈전용해제를 찾고 있다. 본 연구는 그 연장선상의 연구로서 치마버섯(Schizophyllum commune W130)의 균사체를 액체 배양하여 배양액으로부터 분비성 혈전용해효소를 확인하였다. 따라서 혈전용해효소 생산을 위한 최적조건의 검토와 혈전용해효소의 정제 및 그 특성을 규명하여 효소의 안정성을 검토한 후 식품으로서의 이용 이외에도 균사체 배양에 의한 혈전용해효소의 대량생산에 의해 의약품으로서 응용하기 위한 목적이 있다. 치마버섯을 이용한 혈전용해효소 생산최적조건을 검토한 결과 1.5% cornsteep liquor, 2% dextrose, 1.0% soytone, 그리고 initial pH6.0에서 배양온도는 25℃였다. 이러한 조건을 이용하여 150 ml/300 ml flask를 이용하여 배양한 결과 혈전용해효소는 균체 내보다 균체 외에서 약 6배나 많은 것으로 보아 본 버섯 균사체는 효소 분비력이 강한 것으로 나타났다. 균사체를 최적 배양생산 조건에서 접종하여 25℃, 80 rpm으로 8일간 배양한 후 원심 분리하여 균사체를 완전히 제거시키고 상등액만을 조효소액으로 사용하였다. DEAE Sephadex A-50 ion exchange column, Sephadex G-75 gel filtration column, 그리고 Sephadex G-50 gel filtration column chromatography를 수행하여 정제도는 약 67.2배 증가하였으며 약 2.8%의 수율을 보였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE 상에서 perfect protein marker와 함께 전기영동 하여 단일 band를 얻었다. Coomassie 염색에서 정제된 혈전용해효소는 약 17.0kDa임이 확인되었고 zymography 상에서 fibrin이 분해되어 투명 환이 생기는 것을 알 수 있었다. 효소의 최적 pH와 활성온도는 각각 pH6과 45℃로 나타났고 pH는 산성에서는 대체로 안정하고 염기성에서는 약간 불안정하였으나 대체로 넓은 범위의 pH에서 안정하였으며 40℃까지 안정된 활성을 보였다. 또한 본 효소는 대부분의 금속이온에 의해 효소 활성이 약간 저해되거나 아무런 영향을 미치지 못하였으나 이중 Co^(2+)와 Zn^(2+)에 의해 효소 활성이 증가되었으며 Hg^(2+)대해서는 강하게 저해되었고 각종 protease inhibitor를 적용한 결과 EDTA와 phosphoramidon에 의해 현저하게 저해를 받는 것으로 보아 metalloprotease일 것으로 추측된다. 또한 다양한 protease 기질에 대한 분해 반응을 조사한 결과 fibrin에서 특이적으로 분해되었으며, red blood agar plate와 그 외 단백질 기질에 대해서는 분해반응이 일어나지 않았다. 특히 red blood agar plate 분해능에서도 확인되었듯이 적혈구 용해반응이 나타나지 않는 것으로 보아 혈관 내에서의 사용 가능성도 보여지고 있어 인체 내에서도 사용 가능하리라 추측된다. 혈전 분해능에 있어서도 plasminogen이 존재하는 fibrin plate에서는 fibrin을 분해하는 반면, plasminogen을 제거한 fibrin plate에서는 약한 활성을 보이는 것으로 보아 plasminogen activator type으로 추측되어진다. 그리고 tryptic digestion으로 부분적인 아미노산 서열을 분석한 결과 -SSLIEYYIVES-로 확인되었다.
순환계의 질환은 대부분 혈전에 기인하는데 이 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병이나 혈전증이라고 한다. 이러한 순환계 질환들을 치료하기 위한 혈전 용해에 관한 연구가 최근에는 발효식품인 젓갈, 된장, 청국장 등에서 안전한 혈전용해제를 찾고 있다. 본 연구는 그 연장선상의 연구로서 치마버섯(Schizophyllum commune W130)의 균사체를 액체 배양하여 배양액으로부터 분비성 혈전용해효소를 확인하였다. 따라서 혈전용해효소 생산을 위한 최적조건의 검토와 혈전용해효소의 정제 및 그 특성을 규명하여 효소의 안정성을 검토한 후 식품으로서의 이용 이외에도 균사체 배양에 의한 혈전용해효소의 대량생산에 의해 의약품으로서 응용하기 위한 목적이 있다. 치마버섯을 이용한 혈전용해효소 생산최적조건을 검토한 결과 1.5% cornsteep liquor, 2% dextrose, 1.0% soytone, 그리고 initial pH6.0에서 배양온도는 25℃였다. 이러한 조건을 이용하여 150 ml/300 ml flask를 이용하여 배양한 결과 혈전용해효소는 균체 내보다 균체 외에서 약 6배나 많은 것으로 보아 본 버섯 균사체는 효소 분비력이 강한 것으로 나타났다. 균사체를 최적 배양생산 조건에서 접종하여 25℃, 80 rpm으로 8일간 배양한 후 원심 분리하여 균사체를 완전히 제거시키고 상등액만을 조효소액으로 사용하였다. DEAE Sephadex A-50 ion exchange column, Sephadex G-75 gel filtration column, 그리고 Sephadex G-50 gel filtration column chromatography를 수행하여 정제도는 약 67.2배 증가하였으며 약 2.8%의 수율을 보였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE 상에서 perfect protein marker와 함께 전기영동 하여 단일 band를 얻었다. Coomassie 염색에서 정제된 혈전용해효소는 약 17.0kDa임이 확인되었고 zymography 상에서 fibrin이 분해되어 투명 환이 생기는 것을 알 수 있었다. 효소의 최적 pH와 활성온도는 각각 pH6과 45℃로 나타났고 pH는 산성에서는 대체로 안정하고 염기성에서는 약간 불안정하였으나 대체로 넓은 범위의 pH에서 안정하였으며 40℃까지 안정된 활성을 보였다. 또한 본 효소는 대부분의 금속이온에 의해 효소 활성이 약간 저해되거나 아무런 영향을 미치지 못하였으나 이중 Co^(2+)와 Zn^(2+)에 의해 효소 활성이 증가되었으며 Hg^(2+)대해서는 강하게 저해되었고 각종 protease inhibitor를 적용한 결과 EDTA와 phosphoramidon에 의해 현저하게 저해를 받는 것으로 보아 metalloprotease일 것으로 추측된다. 또한 다양한 protease 기질에 대한 분해 반응을 조사한 결과 fibrin에서 특이적으로 분해되었으며, red blood agar plate와 그 외 단백질 기질에 대해서는 분해반응이 일어나지 않았다. 특히 red blood agar plate 분해능에서도 확인되었듯이 적혈구 용해반응이 나타나지 않는 것으로 보아 혈관 내에서의 사용 가능성도 보여지고 있어 인체 내에서도 사용 가능하리라 추측된다. 혈전 분해능에 있어서도 plasminogen이 존재하는 fibrin plate에서는 fibrin을 분해하는 반면, plasminogen을 제거한 fibrin plate에서는 약한 활성을 보이는 것으로 보아 plasminogen activator type으로 추측되어진다. 그리고 tryptic digestion으로 부분적인 아미노산 서열을 분석한 결과 -SSLIEYYIVES-로 확인되었다.
The diseases related to a circulation system of blood largely arise from blood clots, fibrin leading to thrombosis. The studies of fibrinolysis for their therapeutic purposes have extensively progressed. The current fibrinolytic drugs include urokinase from human urine, staphylokinase from Staphyloc...
The diseases related to a circulation system of blood largely arise from blood clots, fibrin leading to thrombosis. The studies of fibrinolysis for their therapeutic purposes have extensively progressed. The current fibrinolytic drugs include urokinase from human urine, staphylokinase from Staphylococcus sp., streptokinase from Streptococcus haemolyticus, tissue plasminogen activator(tPA) from a malignant tumor melanoma cell. However, they showed significant side effects such as hemorrhage, short half-life and high cost. Recently, the studies for the safety of a fibrinolytic agent have been attracted to fermented soybean foods such an Doen-Jang and Chungkook-Jang. This presentation is a continued study of the previous reports, describing a fibrinolytic enzyme excreted during a liquid culture of an edible mushroom. To obtain an effective substance for prevention and treatment of treatment of blood circulation system-related disease, a fibrinolytic enzyme was produced by the liquid culture of mycelium of a mushroom Schizophyllum commune W130. The optimal culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme was determined to be 1.5% corn steep liquor, 2% dextrose, and 1% soytone. Initial pH and temperature were pH6.0 and 25℃, respectively. The intramycelial production of the fibrinolytic enzyme by the culture of the Schizophyllum commune W130 mycelium was approximately 6-fold higher than the extramycelial production. The enzyme was purified by DEAE Sephadex A-50 ion exchange column chromatography, Sephadex G-75 and G-50 gel filtration column chromatography. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 67.2 fold with a recovery of 2.8%. Homogenously purified enzyme was confirmed by single-band on SDS-PAGE. The purified has approximate molecular weight of 17 kDa, and its activity was confirmed by zymography. The optimum pH and temperature for the enzyme activity was pH6.0 and 45℃, respectively. The enzyme activity was pH6.0 and 40°C and over a pH range of 3∼6. The fibrinolytic activity was increased by co^(2+) and Zn^(2+) while it was strongly inhibited by Hg^(2+). In addition, the enzyme was highly inhibited by EDTA, indicating that the enzyme is a metalloprotease. Very importantly, the fibrinolytic enzyme showed a strong substrate specificity for fibrin. Substrates except fibrin, such as the red blood agar plate and some other protease substrates, were not degraded up to 4 hrs at 37°C by the purified enzyme. We have identified a partial amino acid se quence of the purified enzyme, which is -SSLIEYYIVES-, by tryptic digestion.
The diseases related to a circulation system of blood largely arise from blood clots, fibrin leading to thrombosis. The studies of fibrinolysis for their therapeutic purposes have extensively progressed. The current fibrinolytic drugs include urokinase from human urine, staphylokinase from Staphylococcus sp., streptokinase from Streptococcus haemolyticus, tissue plasminogen activator(tPA) from a malignant tumor melanoma cell. However, they showed significant side effects such as hemorrhage, short half-life and high cost. Recently, the studies for the safety of a fibrinolytic agent have been attracted to fermented soybean foods such an Doen-Jang and Chungkook-Jang. This presentation is a continued study of the previous reports, describing a fibrinolytic enzyme excreted during a liquid culture of an edible mushroom. To obtain an effective substance for prevention and treatment of treatment of blood circulation system-related disease, a fibrinolytic enzyme was produced by the liquid culture of mycelium of a mushroom Schizophyllum commune W130. The optimal culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme was determined to be 1.5% corn steep liquor, 2% dextrose, and 1% soytone. Initial pH and temperature were pH6.0 and 25℃, respectively. The intramycelial production of the fibrinolytic enzyme by the culture of the Schizophyllum commune W130 mycelium was approximately 6-fold higher than the extramycelial production. The enzyme was purified by DEAE Sephadex A-50 ion exchange column chromatography, Sephadex G-75 and G-50 gel filtration column chromatography. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 67.2 fold with a recovery of 2.8%. Homogenously purified enzyme was confirmed by single-band on SDS-PAGE. The purified has approximate molecular weight of 17 kDa, and its activity was confirmed by zymography. The optimum pH and temperature for the enzyme activity was pH6.0 and 45℃, respectively. The enzyme activity was pH6.0 and 40°C and over a pH range of 3∼6. The fibrinolytic activity was increased by co^(2+) and Zn^(2+) while it was strongly inhibited by Hg^(2+). In addition, the enzyme was highly inhibited by EDTA, indicating that the enzyme is a metalloprotease. Very importantly, the fibrinolytic enzyme showed a strong substrate specificity for fibrin. Substrates except fibrin, such as the red blood agar plate and some other protease substrates, were not degraded up to 4 hrs at 37°C by the purified enzyme. We have identified a partial amino acid se quence of the purified enzyme, which is -SSLIEYYIVES-, by tryptic digestion.
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