[학위논문]액체크로마토그래피/질량분석법 및 기체크로마토그래피/질량분석법을 이용한 인체 내 뇨 시료 중 4-hydroxynandrolone undecanoate와 그 대사체 분석에 관한 연구 Determination of 4-hydroxynandrolone undecanoate and its metabolite in human urine by LC/MS and GC/MS원문보기
본 연구의 대상 물질인 4-hydroxynandrolone undecanoate (4,17β-dihydroxyestr-4-en-3-one undecanoate)의 기본 구조 물질인 4-hydroxynandrolone은 anabolic steroids인 nandrolone의 유도체로 nandrolone보다 생체 이용률이 높으며 에스트로겐으로의 생화학적인 변환이 억제되어 그에 따른 부작용이 적은 물질로 체내에 흡수되면 합성 동화성 근육 강화 효과를 나타낼 가능성이 있다. 또한 처방전 없이도 쉽게 구매가 가능하므로 운동선수들이 남용할 소지가 많기 때문에 2004년에 세계 반 ...
본 연구의 대상 물질인 4-hydroxynandrolone undecanoate (4,17β-dihydroxyestr-4-en-3-one undecanoate)의 기본 구조 물질인 4-hydroxynandrolone은 anabolic steroids인 nandrolone의 유도체로 nandrolone보다 생체 이용률이 높으며 에스트로겐으로의 생화학적인 변환이 억제되어 그에 따른 부작용이 적은 물질로 체내에 흡수되면 합성 동화성 근육 강화 효과를 나타낼 가능성이 있다. 또한 처방전 없이도 쉽게 구매가 가능하므로 운동선수들이 남용할 소지가 많기 때문에 2004년에 세계 반 도핑 기구 (world anti doping agency, WADA)에 의해서 금지약물로 추가 지정 되었다. 본 연구 대상 물질은 4-hydroxynandrolone의 17번 위치에 undecanoate ester가 치환되어 있어 림프 시스템으로 흡수되는 속도가 빠르고 흡수되는 양도 많은 약물이다. 한편 nandrolone에 대한 연구는 1967년부터 꾸준히 진행 되어온 반면, 그것의 유도체인 4-hydroxynandrolone에 대한 연구는 아직 이루어지지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 HPLCESIMS와 GCMS를 이용하여 사람의 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate 및 그 대사체 인 4-hydroxynandrolone undecanoate-M을 분리하고, 대사체의 구조 확인을 시도하였다. 먼저 뇨 시료 중에서 4-hydroxynandrolone undecanoate의 최적 추출 조건과 HPLCESIMS 및 GCMS의 분석 조건을 확립하였다. 그 다음 HPLCESIMS 및 HPLCESIMSMS를 사용하여 4-hydroxynandrolone undecanoate를 사람에게 경구 투여한 후 채취한 뇨 시료 중에 함유되어 있는 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 구조를 추정하였다. 좀 더 정확한 구조를 확인하기 위하여 silylation에 의한 유도체화를 시킨 후 HPLCESIMSMS에 의해 추정된 대사체의 구조를 GCMS 및 GCMSMS를 사용하여 재확인하였다. 이때, 4-hydroxynandrolone undecanoate 뿐만 아니라 그 대사체의 경우 히드록시기를 포함하고 있으므로 극성이 높고 비휘발성 물질이기 때문에 이들 화합물에 대한 극성을 감소시키기 위하여 silylation에 의한 유도체화 반응을 진행하였다. 우선 뇨 시료로부터 액체-액체 추출법을 사용한 4-hydroxynandrolone undecanoate의 최적 추출 조건은 pH는 8.0이었고, 추출 용매는 디에틸에테르이었다. 바탕 뇨 시료 (blank urine)와 바탕 뇨 시료에 4-hydroxynandrolone undecanoate를 첨가한 뇨 시료 (spiked urine), 약물을 경구 투여 한 후 수집한 뇨 시료 (dosed urine)를 비교하여 본 결과, 4-hydroxynandrolone undecanoate은 검출되지 않았다. 뇨를 통해 배설되는 대사체의 구조를 예측하기 위하여 추출 과정을 거친 후 HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 이용하여 분석한 결과 H+ 첨가 이온인 [M+H]+ (mz 289)와 Na+ 첨가 이온인 [M+Na]+ (mz 311) 그리고 [MH-C4H6O2]+ (mz 203)가 검출되었다. 이와 같은 결과를 통해서 4-hydroxynandrolone undecanoate-M은 4-hydroxynandrolone undecanoate의 기본 구조 물질인 4-hydroxynandrolone의 17번 위치가 산화되어 4-hydroxynandrolone의 분자량 290에서 수소원자에 의한 질량수 2가 감소된 288의 분자량을 가지는 것으로 판단할 수 있었다. HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 사용하여 예측한 대사체를 재확인하기 위하여 GCMS와 GCMSMS로 분석을 시도한 결과, 예측한 대사체의 구조에 세 개의 trimethylsilyl group이 치환된 M+이온인 mz 504 봉우리와 [M-CH3]+이온인 mz 489 봉우리를 검출하였으며, mz 415 ([M-C3H9SiO]+), mz 399 ([M-C4H13SiO]+) 및 mz 310 ([M-C11H18SiO]+)의 토막 이온들을 검출하였다. 따라서 4-hydroxynandrolone undecanoate-M은 HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 이용하여 분석한 결과를 통해 앞서 예측한 구조를 가지는 것으로 판단된다. 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 배설 양상을 조사하기 위하여 4-hydroxynandrolone undecanoate를 성인 남자에게 경구 투여 한 후 채취한 뇨 시료 중에 함유된 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 함량을 조사하여 본 결과, 경구 투여 후 1.5시간에 처음으로 4-hydroxynandrolone undecanoate-M이 검출되었으며 또한 이때 최대 배설량을 나타내었다. 따라서 이 약물은 매우 빠른 속도로 흡수 및 배설이 진행되며, 복용 후 53시간까지 뇨 시료에 존재하는 것으로 보아 체내 잔류성이 높은 약물인 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate와 그 대사체를 효과적으로 추출하고 검출하는 새로운 분석법의 확립으로, 4-hydroxynandrolone undecanoate와 같은 유사 약물의 복용 검사 시 유용한 자료로 이용될 수 있으며 동시에 anabolic steroids가 인체 내에 유입되었을 때 인체 내에서 일으키는 대사 과정을 해석하고 추정 할 수 있는 기초 자료가 될 것으로 기대된다.
본 연구의 대상 물질인 4-hydroxynandrolone undecanoate (4,17β-dihydroxyestr-4-en-3-one undecanoate)의 기본 구조 물질인 4-hydroxynandrolone은 anabolic steroids인 nandrolone의 유도체로 nandrolone보다 생체 이용률이 높으며 에스트로겐으로의 생화학적인 변환이 억제되어 그에 따른 부작용이 적은 물질로 체내에 흡수되면 합성 동화성 근육 강화 효과를 나타낼 가능성이 있다. 또한 처방전 없이도 쉽게 구매가 가능하므로 운동선수들이 남용할 소지가 많기 때문에 2004년에 세계 반 도핑 기구 (world anti doping agency, WADA)에 의해서 금지약물로 추가 지정 되었다. 본 연구 대상 물질은 4-hydroxynandrolone의 17번 위치에 undecanoate ester가 치환되어 있어 림프 시스템으로 흡수되는 속도가 빠르고 흡수되는 양도 많은 약물이다. 한편 nandrolone에 대한 연구는 1967년부터 꾸준히 진행 되어온 반면, 그것의 유도체인 4-hydroxynandrolone에 대한 연구는 아직 이루어지지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 HPLCESIMS와 GCMS를 이용하여 사람의 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate 및 그 대사체 인 4-hydroxynandrolone undecanoate-M을 분리하고, 대사체의 구조 확인을 시도하였다. 먼저 뇨 시료 중에서 4-hydroxynandrolone undecanoate의 최적 추출 조건과 HPLCESIMS 및 GCMS의 분석 조건을 확립하였다. 그 다음 HPLCESIMS 및 HPLCESIMSMS를 사용하여 4-hydroxynandrolone undecanoate를 사람에게 경구 투여한 후 채취한 뇨 시료 중에 함유되어 있는 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 구조를 추정하였다. 좀 더 정확한 구조를 확인하기 위하여 silylation에 의한 유도체화를 시킨 후 HPLCESIMSMS에 의해 추정된 대사체의 구조를 GCMS 및 GCMSMS를 사용하여 재확인하였다. 이때, 4-hydroxynandrolone undecanoate 뿐만 아니라 그 대사체의 경우 히드록시기를 포함하고 있으므로 극성이 높고 비휘발성 물질이기 때문에 이들 화합물에 대한 극성을 감소시키기 위하여 silylation에 의한 유도체화 반응을 진행하였다. 우선 뇨 시료로부터 액체-액체 추출법을 사용한 4-hydroxynandrolone undecanoate의 최적 추출 조건은 pH는 8.0이었고, 추출 용매는 디에틸에테르이었다. 바탕 뇨 시료 (blank urine)와 바탕 뇨 시료에 4-hydroxynandrolone undecanoate를 첨가한 뇨 시료 (spiked urine), 약물을 경구 투여 한 후 수집한 뇨 시료 (dosed urine)를 비교하여 본 결과, 4-hydroxynandrolone undecanoate은 검출되지 않았다. 뇨를 통해 배설되는 대사체의 구조를 예측하기 위하여 추출 과정을 거친 후 HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 이용하여 분석한 결과 H+ 첨가 이온인 [M+H]+ (mz 289)와 Na+ 첨가 이온인 [M+Na]+ (mz 311) 그리고 [MH-C4H6O2]+ (mz 203)가 검출되었다. 이와 같은 결과를 통해서 4-hydroxynandrolone undecanoate-M은 4-hydroxynandrolone undecanoate의 기본 구조 물질인 4-hydroxynandrolone의 17번 위치가 산화되어 4-hydroxynandrolone의 분자량 290에서 수소원자에 의한 질량수 2가 감소된 288의 분자량을 가지는 것으로 판단할 수 있었다. HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 사용하여 예측한 대사체를 재확인하기 위하여 GCMS와 GCMSMS로 분석을 시도한 결과, 예측한 대사체의 구조에 세 개의 trimethylsilyl group이 치환된 M+이온인 mz 504 봉우리와 [M-CH3]+이온인 mz 489 봉우리를 검출하였으며, mz 415 ([M-C3H9SiO]+), mz 399 ([M-C4H13SiO]+) 및 mz 310 ([M-C11H18SiO]+)의 토막 이온들을 검출하였다. 따라서 4-hydroxynandrolone undecanoate-M은 HPLCESIMS와 HPLCESIMSMS를 이용하여 분석한 결과를 통해 앞서 예측한 구조를 가지는 것으로 판단된다. 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 배설 양상을 조사하기 위하여 4-hydroxynandrolone undecanoate를 성인 남자에게 경구 투여 한 후 채취한 뇨 시료 중에 함유된 4-hydroxynandrolone undecanoate-M의 함량을 조사하여 본 결과, 경구 투여 후 1.5시간에 처음으로 4-hydroxynandrolone undecanoate-M이 검출되었으며 또한 이때 최대 배설량을 나타내었다. 따라서 이 약물은 매우 빠른 속도로 흡수 및 배설이 진행되며, 복용 후 53시간까지 뇨 시료에 존재하는 것으로 보아 체내 잔류성이 높은 약물인 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 뇨 시료로부터 4-hydroxynandrolone undecanoate와 그 대사체를 효과적으로 추출하고 검출하는 새로운 분석법의 확립으로, 4-hydroxynandrolone undecanoate와 같은 유사 약물의 복용 검사 시 유용한 자료로 이용될 수 있으며 동시에 anabolic steroids가 인체 내에 유입되었을 때 인체 내에서 일으키는 대사 과정을 해석하고 추정 할 수 있는 기초 자료가 될 것으로 기대된다.
4-hydroxynandrolone which is the base compound of 4-hydroxynandrolone undecanoate is a highly anabolic hormone that possesses unique characteristics. Some of these unique characteristics include enhanced anabolism, inhibition of estrogen biosynthesis. The undecanoate ester represents an 11 carbon si...
4-hydroxynandrolone which is the base compound of 4-hydroxynandrolone undecanoate is a highly anabolic hormone that possesses unique characteristics. Some of these unique characteristics include enhanced anabolism, inhibition of estrogen biosynthesis. The undecanoate ester represents an 11 carbon side chain that increases lipid solubility and fosters lymphatic absorption when taken orally. This study was done the HPLCESIMS screening procedure and the metabolite of 4-hydroxynandrolone undecanoate was also studied by GCMS after silylation for charaterization in human urine . The MS spectrum of the 4-hydroxynandrolone undecanoate includes mz 459 [M+H]+, mz 481 [M+Na]+ and shows the major fragment ions at mz 431, mz 415, mz 397 and mz 371 were detected by HPLCESIMS. If metabolism of 4-hydroxynandrolone undecanoate has the oxidation(positon 17), the molecular mass of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M is expected to be 288 Da. The HPLCESIMS spectrum of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M shows the expected [M+H]+ ion at mz 289, the sodium adduct ion [M+Na]+ at mz 311 and the potassium adduct ion [M+K]+ at mz 327. The major fragment ions at mz 271, mz 255 and mz 240 also detect and MSMS spectrum of mz 289 from 4-hydroxynandrolone undecanoate-M as the precursor ion, shows at mz 203 and mz 137. These results were suggested that a 4-hydroxynandrolone undecanoate-M has been oxidated at position 17 from 4-hydroxynandrolone, which is the base compound of 4-hydroxynandrolone undecanoate. We used GCMS for characterization of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M in dosed urine. Derived 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was found from the extracted ion chromatogram of [M]+ ion at mz 504. The GCMSMS spectrum of derived 4-hydroxynandrolone undecanoate-M shows the molecular ion [M]+ at mz 504 and the base ion at mz 399 [M-C4H13SiO]+. The main fragment ions were observed at mz 489 [M-CH3]+, mz 415 [M-C3H9SiO ]+ and mz 310 [M-C11H18SiO ]+. We have evaluated a screening method and a confirmation method for 4-hydroxynandrolone undecanoate in human urine. When we compared the chromatograms of the blank urine, spiked urine and dosed urine, we found an unknown metabolite that was shown to be 2 Da lighter than 4-hydroxynandrolone by HPLCESIMS and GCMS. Excretion profile of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was studied in dosed urine. The highest level of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was excreted in 0~2 hr dosed urine and its metabolite is remained as trace level even after dosing 53 hr. This results showed that 4-hydroxynandrolone undecanoate-M has been oxidated at position 17 from 4-hydroxynandrolone. Also, this methods can be appropriate to the screening and confirmation of 4-hydroxynandrolone undecanoate and its metabolite.
4-hydroxynandrolone which is the base compound of 4-hydroxynandrolone undecanoate is a highly anabolic hormone that possesses unique characteristics. Some of these unique characteristics include enhanced anabolism, inhibition of estrogen biosynthesis. The undecanoate ester represents an 11 carbon side chain that increases lipid solubility and fosters lymphatic absorption when taken orally. This study was done the HPLCESIMS screening procedure and the metabolite of 4-hydroxynandrolone undecanoate was also studied by GCMS after silylation for charaterization in human urine . The MS spectrum of the 4-hydroxynandrolone undecanoate includes mz 459 [M+H]+, mz 481 [M+Na]+ and shows the major fragment ions at mz 431, mz 415, mz 397 and mz 371 were detected by HPLCESIMS. If metabolism of 4-hydroxynandrolone undecanoate has the oxidation(positon 17), the molecular mass of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M is expected to be 288 Da. The HPLCESIMS spectrum of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M shows the expected [M+H]+ ion at mz 289, the sodium adduct ion [M+Na]+ at mz 311 and the potassium adduct ion [M+K]+ at mz 327. The major fragment ions at mz 271, mz 255 and mz 240 also detect and MSMS spectrum of mz 289 from 4-hydroxynandrolone undecanoate-M as the precursor ion, shows at mz 203 and mz 137. These results were suggested that a 4-hydroxynandrolone undecanoate-M has been oxidated at position 17 from 4-hydroxynandrolone, which is the base compound of 4-hydroxynandrolone undecanoate. We used GCMS for characterization of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M in dosed urine. Derived 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was found from the extracted ion chromatogram of [M]+ ion at mz 504. The GCMSMS spectrum of derived 4-hydroxynandrolone undecanoate-M shows the molecular ion [M]+ at mz 504 and the base ion at mz 399 [M-C4H13SiO]+. The main fragment ions were observed at mz 489 [M-CH3]+, mz 415 [M-C3H9SiO ]+ and mz 310 [M-C11H18SiO ]+. We have evaluated a screening method and a confirmation method for 4-hydroxynandrolone undecanoate in human urine. When we compared the chromatograms of the blank urine, spiked urine and dosed urine, we found an unknown metabolite that was shown to be 2 Da lighter than 4-hydroxynandrolone by HPLCESIMS and GCMS. Excretion profile of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was studied in dosed urine. The highest level of 4-hydroxynandrolone undecanoate-M was excreted in 0~2 hr dosed urine and its metabolite is remained as trace level even after dosing 53 hr. This results showed that 4-hydroxynandrolone undecanoate-M has been oxidated at position 17 from 4-hydroxynandrolone. Also, this methods can be appropriate to the screening and confirmation of 4-hydroxynandrolone undecanoate and its metabolite.
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