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본 연구는 2-D PAGE와 MALDI-TOFMS를 이용하여 흰쥐의 뇌에서 whole synaptic vesicle에 대한 proteome map을 완성하고자 하였다. Differential centrifugation과 hypoosmotic shock, sucrose gradient centrifugation을 이용한 정밀한 정제과정을 거쳐 쥐의 뇌조직에서 고도로 정제된 synaptic vesicles을 분리하였으며, 분리된 synaptic vesicle의 양은 전체 단백질양의 0.18% (wv)에 해당하였다. ...

본 연구는 2-D PAGE와 MALDI-TOFMS를 이용하여 흰쥐의 뇌에서 whole synaptic vesicle에 대한 proteome map을 완성하고자 하였다. Differential centrifugation과 hypoosmotic shock, sucrose gradient centrifugation을 이용한 정밀한 정제과정을 거쳐 쥐의 뇌조직에서 고도로 정제된 synaptic vesicles을 분리하였으며, 분리된 synaptic vesicle의 양은 전체 단백질양의 0.18% (wv)에 해당하였다. 전자현미경으로 관찰한 결과 고도로 정제된 균질한 모양의 synaptic vesicles임을 확인 하였다. 정제된 synaptic vesicle 단백질 시료는 immobilized pH gradient strip (pH 3-10)을 사용하여 first-dimensional isoelectric focusing을 한 다음, 10% SDS-PAGE로 second-dimension electrophoresis를 실행하였다. Synaptic vesicle 단백질의 whole map을 얻기 위한 최적의 isoelectric focusing 조건을 확립 하였다. 얻어진 단백질은 in-gel digestion 후 MALDI-TOFMS를 거쳐 단백질을 확인하였다. 13 cm gel을 사용하여 619개의 단백질 spot을 얻었고 그 중에서 총 64개의 synaptic vesicle과 관련된 단백질을 확인하였다. 단백질 spot들은 대부분 50 kDa 이하의 비교적 낮은 분자량을 가진 것이었으며, pI값은 5-8의 범위에 걸쳐있었다. 확인된 단백질은 vesicle 운반과, signaling, 에너지 대사, 구조유지, 그 밖에 몇 종의 효소와 수용체 등의 기능으로 나눌 수 있었으며, 기능이 알려지지 않은 단백질도 다수 포함되어 있었다. 이 연구 는 synaptic vesicles을 분석하여 기존의 뇌조직에 존재하고 있는 단백질의 database를 향상시키고, 원심분리를 이용한 전처리 단계와 지질 성분이 풍부한 분획에 대한 최적의 isoelectric focusing 조건을 정립함으로써 proteomics 방법의 실험적 한계를 개선하는데 기여하였다고 사료된다. 또한 이 연구결과는 synaptic vesicle cycle을 포함하여 그들 사이의 정보 전달 기전을 이해하고 연구하는데 기여할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Synaptic vesicle proteins and their markers are useful tools for the understanding of the complex life cycle of synaptic vesicles underlying intercellular communication. Whole proteomes of synaptic vesicle from rat brains were analyzed by using 2-dimentional electrophoresis (2-DE) and matrix-assiste...

Synaptic vesicle proteins and their markers are useful tools for the understanding of the complex life cycle of synaptic vesicles underlying intercellular communication. Whole proteomes of synaptic vesicle from rat brains were analyzed by using 2-dimentional electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorptionionization-time of flightmass spectrometry (MALDI-TOF). In the present study, I have prepared a highly purified synaptic vesicle fraction from rat brains by sequentially differential centrifugation, hypoosmotic shock, and sucrose-density gradient centrifugation. Proteins were separated by isoelectric focusing on immobilized IPG DryStrips in the pH range of 3-10 (linear), and then by 10% gradient SDS-PAGE gels. Protein identification was done by peptide mass fingerprinting with MALDI-TOFMS. Yield of the synaptic vesicle fraction to brain homogenate was 0.18% and its purity was confirmed by using an electron microscope. This study identified the optimal voltage conditions of IEF for the separation of synaptic vesicle proteins. A total of 619 protein spots were obtained from 13 cm gels. Synaptic vesicle proteins were mostly located on low molecular weight range at pH ranges of 5-8. At present, all 64 proteins were identified from 2-DE and MALDI-TOFMS. The identified proteins involved in the biogenesis and trafficking of vesicle, energy metabolism, signal transduction, transport and unknown function. An updated map of rat brain proteins is presented and the method may be applied to a field for improving the limited proteomics approach to brain protein expression.

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