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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 과습스트레스에 따른 수수의 논 재배를 과학적으로 판별하기 위하여 수수의 초기생육시기인 3엽기와 5엽기에 논 및 과습 논에서의 단백질 발현양상의 차이를 밝히 고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 실험 재료는 과습 처리 10일 후에 각각의 대조구와 처리구에서 수수 잎을 채취하였으며, 채취 후 즉시 액체 질소에 담가 두었던 50 ml 튜브에 넣은 후 곧바로 액체 질소에 동결시켜 시료의 변성을 최소화시켰다.
- 파종이 완료된 pot는 충북대학교 부속 농장 온실에서 재배하였다. 수수 발아 후 5일 뒤, 3엽기에 도달하여 3엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다. 또한, 발아 후 10일 뒤에 5엽기에 도달하여 5엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다.
- 수수 발아 후 5일 뒤, 3엽기에 도달하여 3엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다. 또한, 발아 후 10일 뒤에 5엽기에 도달하여 5엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다. 각각의 처리구에 따른 대조구를 나누어 처리하였다.
- 또한, 발아 후 10일 뒤에 5엽기에 도달하여 5엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다. 각각의 처리구에 따른 대조구를 나누어 처리하였다. 처리구의 경우 수수가 심어져 있는 Wagner pot를 더 큰 통에 넣은 후에 pot 밑면이 급수구로부터 수분이 공급되어 토양 표면 10 cm 깊이까지 포화되도록 처리하였다.
- 5 ㎖ 첨가 후 다시 voltexing, 원심분리 (20,000 g, 4℃, 5분)를 실시하였으며 세척 후 speed vacuum centrifuge를 사용하여 잔여 에탄올이 모두 증발되어 제거될 때까지 10분 정도 건조시켰다. 건조된 시료에 lysis buffer [8M Urea, 2% NP-40, 2% Ampholine (pH 3-10), 5% 2-Mercaptoethanol, 5% Polyvinylpyrrolidone (PVP-40)]를 추가하여 1시간 동안 상온에서 voltexing하여 반응시켜 준 후 원심분리 (20,000 g, 25℃, 20분)하여 상층액을 취한 후 Brad Ford 분석을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다.
- 샘플들의 염을 모두 제거한 후 각각의 샘플 10μl를 auto sampler (Surveyor)를 사용하여 C18 trap column (I.D., 300 μl, length 5mm, particle size 5 μl, LC Packings)에 주입한 후 20 μl/min의 flow rate로 농축하였다.
- 일차원 전기영동(one-dimentional electrophoresis : 1-DE) 은 pI (isoelectric point)를 이용한 전기영동으로, 11cm straw gel [Urea, 30% acrylamide, 10% NP-40, Ampholine (pH 3-10), 10% APS, TEMED] 위에 시료를 주입하여 전기영동 하였다. 전압은 150V에서 1시간, 300V에서 1시간, 500V에서 16시간으로 전압을 증가 조정한 후 전기영동 하였다.
- 2차 전기영동 분석을 위해서 12% separating gel [1.5M Tris (pH6-8), 30% acrylamide, 10% APS, 10% SDS, TEMED]과 5% Staking gel [0.5M Tris (pH6-8), 30% acrylamide, 10% APS, 10% SDS, TEMED]에 loading 시킨 후 Coomassie brilliant blue (CBB G-250)로 염색해주었다. 모든 실험은 3반복으로 실행되었으며, 염색 후 각각의 gel은 스캐너(HP Scanjet G4010, USA)를 이용하여 스캔했다.
- 5M Tris (pH6-8), 30% acrylamide, 10% APS, 10% SDS, TEMED]에 loading 시킨 후 Coomassie brilliant blue (CBB G-250)로 염색해주었다. 모든 실험은 3반복으로 실행되었으며, 염색 후 각각의 gel은 스캐너(HP Scanjet G4010, USA)를 이용하여 스캔했다. 또한, 각각의 2D-gel image analysis는 Progenesis samespot program (Nonlinear Dynamics, Newcastle-upon-Tyne, UK)을 사용하여 분석하였다.
- 모든 실험은 3반복으로 실행되었으며, 염색 후 각각의 gel은 스캐너(HP Scanjet G4010, USA)를 이용하여 스캔했다. 또한, 각각의 2D-gel image analysis는 Progenesis samespot program (Nonlinear Dynamics, Newcastle-upon-Tyne, UK)을 사용하여 분석하였다.
- 단백질 질량 분석은 surveyor HPLC system과 nano-ESI 소스가 장착된 Finningan LTQ-FT-ICR 질량 분석기(Therm Electon, Bremen, Germany)로 구성된 Nano-LC/MS 시스템으로 수행되었다. 샘플들의 염을 모두 제거한 후 각각의 샘플 10μl를 auto sampler (Surveyor)를 사용하여 C18 trap column (I.
- , 300 μl, length 5mm, particle size 5 μl, LC Packings)에 주입한 후 20 μl/min의 flow rate로 농축하였다. 이후 MS와 MS/MS acquisition을 반복하며 data-dependent mode로 작동 하였고, 실험 조건은 2.2kV spray voltage, 220℃ ion transfer tube temperature, 1.3 millitors collision gas pressure로 모두 세팅하였다. MS/MS auquisition에서 ion 검출은 500 counts를 한계점으로, 활성화는 q=0.
- 3 millitors collision gas pressure로 모두 세팅하였다. MS/MS auquisition에서 ion 검출은 500 counts를 한계점으로, 활성화는 q=0.25, 활성화시간은 30 ms로 설정하였다. LTQ- FT-ICR MS를 이용하여 알아낸 단백질 펩티드의 MS spectra data값은 먼저 MASCOT ver 2.
- 25, 활성화시간은 30 ms로 설정하였다. LTQ- FT-ICR MS를 이용하여 알아낸 단백질 펩티드의 MS spectra data값은 먼저 MASCOT ver 2.0 (Matrix Science, UK)의 데이터베이스에서 검색하였으며, 펩티드 오차범위는 50 ppm, fragment ion 오차 범위는 0.5 DA로 설정하였다. 그 결과를 토대로 수집한 protein description과 peptide sequence 정보를 PIR (http://pir.
- 5 DA로 설정하였다. 그 결과를 토대로 수집한 protein description과 peptide sequence 정보를 PIR (http://pir.georgetown.edu)을 이용하여 protein sequence를 검색하였다. 최종 확인된 수수 잎의 단백질은 분자량과 pI 2가지 항목을 통해 각각의 특성에 따라 분류하여 정리 하였다.
- edu)을 이용하여 protein sequence를 검색하였다. 최종 확인된 수수 잎의 단백질은 분자량과 pI 2가지 항목을 통해 각각의 특성에 따라 분류하여 정리 하였다.
- 2와 같다. 발현된 수많은 단백질 스팟을 Progenesis samespot software program을 이용하여 이미지 분석을 통해 375개의 단백질 스팟으로 구분했다. 구분된 375개의 단백질 스팟 중 서로 다른 양상을 보이며 비교 가능한 단백질 스팟 74 개를 선택하여 동정한 결과 실험구 중 토양 과습 처리구에서 20개의 단백질 스팟들에서 up-regulated 된 반면에, 5개의 단백질 스팟들에서는 down-regulated 된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- (2012)은 콩 묘목을 과습처리 후 동정한 결과 과습처리에서 무처리에 비해 4개의 단백질 스팟들에서 down-regulated 된 것을 확인하였다. 이미지 분석 시 기준이 된 reference gel을 질량 분석기로 분석, 동정하였고, 동정결과 각각의 스팟은 구획을 나누어 numbering하여 표시하였다(Fig. 4).
- LTQ-FT-ICR MS를 이용하여 토양의 과습 처리 10일 후 수수 잎에서 추출된 단백질들을 동정하였다. 총 74개의 단백질을 동정하였으며, 이렇게 동정된 단백질들을 식별하여 분류한 것은 Table 1과 같다.
대상 데이터
- 본 시험은 2016년 농촌진흥청에서 분양 받은 남풍찰 수수를 이용하여 수수 과습 스트레스 관련 단백질 분석을 위한 재료로 이용하였다. 수수 재배를 위해 종자는 수도용 상토와 충북대학교 부속 농장 밭토양과 1:2 비율로 섞어서 만든 토양을 2.
- 본 시험은 2016년 농촌진흥청에서 분양 받은 남풍찰 수수를 이용하여 수수 과습 스트레스 관련 단백질 분석을 위한 재료로 이용하였다. 수수 재배를 위해 종자는 수도용 상토와 충북대학교 부속 농장 밭토양과 1:2 비율로 섞어서 만든 토양을 2.5 ㎏씩 채운 Wagner pot (1/10000단보, 한진)에 pot당 4립씩 직파하였다. 파종이 완료된 pot는 충북대학교 부속 농장 온실에서 재배하였다.
- 5 ㎏씩 채운 Wagner pot (1/10000단보, 한진)에 pot당 4립씩 직파하였다. 파종이 완료된 pot는 충북대학교 부속 농장 온실에서 재배하였다. 수수 발아 후 5일 뒤, 3엽기에 도달하여 3엽기 과습 처리 실험을 10일간 진행하였다.
- 이미지 분석 결과를 바탕으로 하여 각각의 gel에서 단백질스팟들을 선정하였다. In-gel digestion은 In-Gel Tryptic Digestion Kit (Thermo SCIENTIFIC)을 사용하여 시행하였다.
이론/모형
- 단백질 추출에서 효과적인 액체질소를 이용한 세포벽 파쇄 그리고 불순물 제거를 위한 TCA 침전법을 이용하여 수수 잎에서의 단백질 추출을 시행하였다. 50ml 튜브에 10% TCA와 0.
성능/효과
- 처리구의 경우 수수가 심어져 있는 Wagner pot를 더 큰 통에 넣은 후에 pot 밑면이 급수구로부터 수분이 공급되어 토양 표면 10 cm 깊이까지 포화되도록 처리하였다. 처리기간 10일 동안 매일 토양수분량 측정을 실시하여 대조구에서는 토양수분함량을 평균 25%로 유지하였고, 처리구에서는 평균 58%로 유지하였다. 실험 재료는 과습 처리 10일 후에 각각의 대조구와 처리구에서 수수 잎을 채취하였으며, 채취 후 즉시 액체 질소에 담가 두었던 50 ml 튜브에 넣은 후 곧바로 액체 질소에 동결시켜 시료의 변성을 최소화시켰다.
- 발현된 수많은 단백질 스팟을 Progenesis samespot software program을 이용하여 이미지 분석을 통해 375개의 단백질 스팟으로 구분했다. 구분된 375개의 단백질 스팟 중 서로 다른 양상을 보이며 비교 가능한 단백질 스팟 74 개를 선택하여 동정한 결과 실험구 중 토양 과습 처리구에서 20개의 단백질 스팟들에서 up-regulated 된 반면에, 5개의 단백질 스팟들에서는 down-regulated 된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). Khatoon et al.
- 7이다. Molecular function에서는 촉매 활성(catalytic activity)와 산화환원효소활성(oxidoreductase activity)가 각각 15%, 14%로 가장 많이 확인 되었으며 cellular component에서는 세포질, 색소체가 각각 30%, 27%로 가장 많이 확인되었고, biological process에서는 탄수화물 대사과정 (carbohydrate metabolic process), 대사과정(metabolic process)가 각각 27%, 19%로 가장 많은 양을 차지하였다. 탄수화물 대사 과정에 작용되는 단백질들이 가장 많이 발견되는 것으로 보아 수수의 3엽기와 5엽기에 과습 스트레스가 탄수화물 대사과정에 많은 영향을 주는 것으로 판단되었으며, 이 외에도 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 단백질이 5%가 나타나는 등 여전히 기능 해석이 필요한 단백질이 존재하는 것으로 생각되었다.
- 8과 같다. 3엽기와 5엽기 모두에서 대조구보다 실험구에서 더 많이 발현되는 양상을 보였는데, 이는 과습 스트레스를 받았을 때, antistress 기능을 하는 단백질로 발현함으로써 그 피해를 줄이려는 경향을 보였다고 사료된다. 또한, 5엽기에서보다 3엽기에서의 발현 양이 대폭 증가되어 있는 것을 보아 어린 시기에 작물에서 말산탈수소효소(malate dehydrogenase)가 더 많이 발현되는 양상을 보임을 확인할 수 있었다.
- 3엽기와 5엽기 모두에서 대조구보다 실험구에서 더 많이 발현되는 양상을 보였는데, 이는 과습 스트레스를 받았을 때, antistress 기능을 하는 단백질로 발현함으로써 그 피해를 줄이려는 경향을 보였다고 사료된다. 또한, 5엽기에서보다 3엽기에서의 발현 양이 대폭 증가되어 있는 것을 보아 어린 시기에 작물에서 말산탈수소효소(malate dehydrogenase)가 더 많이 발현되는 양상을 보임을 확인할 수 있었다.
- 9와 같다. 대조구에서보다 실험구에서 많이 발현되는 것으로 보아, 과습 스트레스에 의해서 광합성에 부정적인 영향을 받아 부족한 광합성 양을 채우기 위해 실험구에서 이 단백질이 더 많이 발현된 것으로 사료된다.
- 그림에서 보듯이 대조구에 비해서 과습 처리구에서 발현양이 다소 증가한 것을 볼 수 있다. 이를 토대로 과습 스트레스가 세포내 탄수화물 대사과정에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.
- 이 단백질 역시 3엽기와 5엽기에서 모두 무처리보다 과습 처리에서 더 많이 발현되는 양상을 확인할 수 있었다(Fig. 12). 따라서 과습 스트레스로 인해서 세포에 손상이 유발됨을 알 수 있었고, 이에 반응하여 과습 처리구에서 해당 단백질의 발현양이 증가된 것으로 사료된다.
- 12). 따라서 과습 스트레스로 인해서 세포에 손상이 유발됨을 알 수 있었고, 이에 반응하여 과습 처리구에서 해당 단백질의 발현양이 증가된 것으로 사료된다.
- 밭작물 중의 하나인 수수의 재배기간 중 장기간 지속되는 토양의 과습 상태는 수수의 생장 저하를 야기하는 요소로서 작용한다. 수수잎을 이용한 수수의 3엽기, 5엽기 과습 처리시의 단백질을 동정한 결과 74개의 단백질들을 동정하였다. LTQ-FI-ICR MS로 분석한 결과 carbohydrate metabolic process, metabolic process, cellular metabolic compound salvage와 관련된 단백질들이 약 50% 정도를 차지하며, 과습 스트레스를 받을 때 영향을 미치는 것으로 보였다.
- 수수잎을 이용한 수수의 3엽기, 5엽기 과습 처리시의 단백질을 동정한 결과 74개의 단백질들을 동정하였다. LTQ-FI-ICR MS로 분석한 결과 carbohydrate metabolic process, metabolic process, cellular metabolic compound salvage와 관련된 단백질들이 약 50% 정도를 차지하며, 과습 스트레스를 받을 때 영향을 미치는 것으로 보였다. Carbohydrate metabolic process와 관련된 malate dehydrogenase 단백질과 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 단백질은 과습 스트레스를 받았을경우 3엽기와 5엽기 모두 단백질 발현양이 증가하였다.
- 이러한 단백질들은 과습 스트레스에 대한 antistress 기능을 하는 단백질로 알려져 있는데, 과습 스트레스에 반응하여 해당 단백질들의 발현양이 증가한 것으로 사료된다. 광합성과 관련된 oxygenevolving enhancer protein 1 단백질은 대조구에서 보다 처리 구에서 발현양이 다소 증가한 것을 볼 수 있었다. 또한, 3엽기에 비해서 5엽기에서 발현양이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 광합성과 관련된 oxygenevolving enhancer protein 1 단백질은 대조구에서 보다 처리 구에서 발현양이 다소 증가한 것을 볼 수 있었다. 또한, 3엽기에 비해서 5엽기에서 발현양이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Response to oxidative stress와 관련된 probable phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 단백질과 superoxide dismutase 단백질 모두 5엽기 처리구에서 가장 많은 발현량을 보였다.
- 또한, 3엽기에 비해서 5엽기에서 발현양이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Response to oxidative stress와 관련된 probable phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 단백질과 superoxide dismutase 단백질 모두 5엽기 처리구에서 가장 많은 발현량을 보였다. 이는 과습 스트레스에 의한 활성산소 발생이 5엽기 처리구에서 가장 많았고, 이에 따라 항산화방어기작을 하는 단백질의 발현이 증가한 것으로 여겨졌다.
- 분자 크기 별로 단백질들을 비교한 결과 모두 분자량이 20kDa∼80 kDa에 속하는 것을 확인하였고, 그 중에 무게가 20kDa∼40 kDa 크기에 속한 단백질들이 64%를 차지하였으며, 중분자 범위(50 kDa∼80 kDa)의 경우에는 약 10% 정도 분포하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 등전점(pI) 또한 배수성에 관계없이 pI 6∼7 사이에서 약 50% 로 가장 많은 분포를 보였으며, pI 5∼6 에서도 약 31%로 두 번째로 많은 단백질 분포를 보여 pI 5∼7 사이의 단백질들이 약 81% 이상을 차지하였다.
- 등전점(pI) 또한 배수성에 관계없이 pI 6∼7 사이에서 약 50% 로 가장 많은 분포를 보였으며, pI 5∼6 에서도 약 31%로 두 번째로 많은 단백질 분포를 보여 pI 5∼7 사이의 단백질들이 약 81% 이상을 차지하였다. 이것으로 보아 약산성에서 중성을 띈 단백질들이 염기성을 띈 단백질 보다 수수 잎에 많이 존재함을 알 수 있었다(Fig. 6). 애기 장대는 대부분 10 kDa∼50 kDa의 작은 분자량을 가진 단백질이 가장 많았으며, 염기성 단백질이 많이 포함 되어 있다고 보고하여(Millar et al.
- Molecular function에서는 촉매 활성(catalytic activity)와 산화환원효소활성(oxidoreductase activity)가 각각 15%, 14%로 가장 많이 확인 되었으며 cellular component에서는 세포질, 색소체가 각각 30%, 27%로 가장 많이 확인되었고, biological process에서는 탄수화물 대사과정 (carbohydrate metabolic process), 대사과정(metabolic process)가 각각 27%, 19%로 가장 많은 양을 차지하였다. 탄수화물 대사 과정에 작용되는 단백질들이 가장 많이 발견되는 것으로 보아 수수의 3엽기와 5엽기에 과습 스트레스가 탄수화물 대사과정에 많은 영향을 주는 것으로 판단되었으며, 이 외에도 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 단백질이 5%가 나타나는 등 여전히 기능 해석이 필요한 단백질이 존재하는 것으로 생각되었다.
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