[학위논문]단백질체 분석을 통한 암 유발 유전자 H-Ras에 의한 신호전달과정에 대한 연구 (A) proteomics approach for dissecting H-Ras signaling networks in NIH/3T3 mouse embryonic fibroblast cells원문보기
박정욱
(Graduate School, Yonsei University
Dept. of Biochemistry
국내석사)
종양 단백질인 H-Ras는 잘 알려진 p21 단백질이다. 이것은 세포신호전달 과정에서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 세포신호전달 과정을 이해하기 위해서 종양 단백질인 H-Ras가 일정하게 발현되는 NIH/3T3 세포주와 발현양상을 조절할 수 있는 NIH/3T3 세포주를 만들었다. 전자의 경우 CMV 증진자(...
종양 단백질인 H-Ras는 잘 알려진 p21 단백질이다. 이것은 세포신호전달 과정에서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 세포신호전달 과정을 이해하기 위해서 종양 단백질인 H-Ras가 일정하게 발현되는 NIH/3T3 세포주와 발현양상을 조절할 수 있는 NIH/3T3 세포주를 만들었다. 전자의 경우 CMV 증진자(promoter)에 의해서 H-Ras 단백질의 발현이 일정하게 유지되고, 후자의 경우 Antibiotics인 doxycycline에 의해서 발현을 조절할 수 있게 만들었다. 이제 H-Ras 종양 단백질을 발현하는 세포주에서의 proteome profiles 목록을 보이고 이것이 가지는 생물학적 견해를 해석하기 위해서 2차 전기영동 방법, 정량적 이미지 분석, MALDI-TOF 를 사용한 질량 분석 방법을 이용해서 2가지의 세포주에서 상호비교를 하여 전체 단백질체의 변화를 볼 수 있었다. 같은 단백질의 발현양상이 일정한 세포주와 조절할 수 있는 세포주를 사용하는 것은 더욱 실험자료의 재현성을 줄 수 있을 것이다. 종양 단백질인 H-Ras에 의해서 수 많은 단백질들의 변화를 볼 수 있었고, 그 중 64(36개의 양적 증가 단백질들과, 28개의 감소 단백질들)개의 단백질들이 2개의 세포주에서 모두 변화를 보인다는 것을 찾을 수 있었다. 여기에다가 H-Ras 단백질의 영향을 받는 Raf-1 단백질에 의한 세포신호전달 과정만을 특이적으로 확인하기 위해서 H-Ras (G12V/T35S) 돌연변이 단백질을 이번 역시도 일정하게 발현하는 세포주와 발현양상을 조절할 수 있는 세포주 2개에서 단백질체 분석결과로 얻은 69개의 단백질표를 얻었다. 이것을 상호 비교하여서 13개의 단백질이 Raf-1에 의해서 특이적으로 발현이 조절 될 것이라는 자료를 가지고, Western blot과 RT-PCR을 가지고 13개의 단백질 변화의 재현성을 확인하였다. 전체적으로 H-Ras에 의한 세포내의 단백질 조절 양상을 확인하였고, 세부적으로는 특정 Raf-1 단백질의 활성에 의해서 생기는 단백질의 변화 양상 역시 확인할 수 있었다.
종양 단백질인 H-Ras는 잘 알려진 p21 단백질이다. 이것은 세포신호전달 과정에서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 세포신호전달 과정을 이해하기 위해서 종양 단백질인 H-Ras가 일정하게 발현되는 NIH/3T3 세포주와 발현양상을 조절할 수 있는 NIH/3T3 세포주를 만들었다. 전자의 경우 CMV 증진자(promoter)에 의해서 H-Ras 단백질의 발현이 일정하게 유지되고, 후자의 경우 Antibiotics인 doxycycline에 의해서 발현을 조절할 수 있게 만들었다. 이제 H-Ras 종양 단백질을 발현하는 세포주에서의 proteome profiles 목록을 보이고 이것이 가지는 생물학적 견해를 해석하기 위해서 2차 전기영동 방법, 정량적 이미지 분석, MALDI-TOF 를 사용한 질량 분석 방법을 이용해서 2가지의 세포주에서 상호비교를 하여 전체 단백질체의 변화를 볼 수 있었다. 같은 단백질의 발현양상이 일정한 세포주와 조절할 수 있는 세포주를 사용하는 것은 더욱 실험자료의 재현성을 줄 수 있을 것이다. 종양 단백질인 H-Ras에 의해서 수 많은 단백질들의 변화를 볼 수 있었고, 그 중 64(36개의 양적 증가 단백질들과, 28개의 감소 단백질들)개의 단백질들이 2개의 세포주에서 모두 변화를 보인다는 것을 찾을 수 있었다. 여기에다가 H-Ras 단백질의 영향을 받는 Raf-1 단백질에 의한 세포신호전달 과정만을 특이적으로 확인하기 위해서 H-Ras (G12V/T35S) 돌연변이 단백질을 이번 역시도 일정하게 발현하는 세포주와 발현양상을 조절할 수 있는 세포주 2개에서 단백질체 분석결과로 얻은 69개의 단백질표를 얻었다. 이것을 상호 비교하여서 13개의 단백질이 Raf-1에 의해서 특이적으로 발현이 조절 될 것이라는 자료를 가지고, Western blot과 RT-PCR을 가지고 13개의 단백질 변화의 재현성을 확인하였다. 전체적으로 H-Ras에 의한 세포내의 단백질 조절 양상을 확인하였고, 세부적으로는 특정 Raf-1 단백질의 활성에 의해서 생기는 단백질의 변화 양상 역시 확인할 수 있었다.
Oncogenic H-Ras, the well-known p21 protein, plays an important role in many parts of cell signaling pathways. To elucidate an understanding into this network, various oncogenic H-Ras stably and inducibly expressing NIH/3T3 mouse embryonic fibroblast cell clones have been established, which are expr...
Oncogenic H-Ras, the well-known p21 protein, plays an important role in many parts of cell signaling pathways. To elucidate an understanding into this network, various oncogenic H-Ras stably and inducibly expressing NIH/3T3 mouse embryonic fibroblast cell clones have been established, which are expressing G12V H-Ras and G12R H-Ras proteins under the influence of strong CMV promoter and under the tight control of expression by an antibiotics, doxycycline, respectively. A catalogue of proteome profiles in total cell lysate derived from the oncogenic H-Ras expressing NIH/3T3 cells was provided. In this biological context, total proteome changes were compared by the combined methods of 2-DE, quantitative image analysis and MALDI-TOF MS analysis both using stable expression system as well as inducible expression system. It was a good method that using two kinds of expression system on verification makes data confirmed. There were a large number of common targets for oncogenic H-Ras, which were identified in both oncogenic H-Ras cell lines and consisted on 64 proteins (36 up-regulated and 28 down-regulated). To figure out the specific Raf signal effect of H-Ras, the protein profile (69 proteins are differentially regulated) of partial loss of function mutant H-Ras (G12V/T35S) was compared with that of oncogenic H-Ras (G12V and G12R). Only thirteen proteins were matched and differentially regulated expression was further confirmed for some subsets of candidates by Western blot analysis using specific antibodies. It is performed that semi-quantitative RT?CR with specific primer sets for gene products that are differentially regulated with G12V/T35S Ras expression. Taken together, results obtained and present here show that the comparative analysis of proteome from oncogenic H-Ras expressing cells has yielded interpretable data to elucidate the protein network directly and/or indirectly.
Oncogenic H-Ras, the well-known p21 protein, plays an important role in many parts of cell signaling pathways. To elucidate an understanding into this network, various oncogenic H-Ras stably and inducibly expressing NIH/3T3 mouse embryonic fibroblast cell clones have been established, which are expressing G12V H-Ras and G12R H-Ras proteins under the influence of strong CMV promoter and under the tight control of expression by an antibiotics, doxycycline, respectively. A catalogue of proteome profiles in total cell lysate derived from the oncogenic H-Ras expressing NIH/3T3 cells was provided. In this biological context, total proteome changes were compared by the combined methods of 2-DE, quantitative image analysis and MALDI-TOF MS analysis both using stable expression system as well as inducible expression system. It was a good method that using two kinds of expression system on verification makes data confirmed. There were a large number of common targets for oncogenic H-Ras, which were identified in both oncogenic H-Ras cell lines and consisted on 64 proteins (36 up-regulated and 28 down-regulated). To figure out the specific Raf signal effect of H-Ras, the protein profile (69 proteins are differentially regulated) of partial loss of function mutant H-Ras (G12V/T35S) was compared with that of oncogenic H-Ras (G12V and G12R). Only thirteen proteins were matched and differentially regulated expression was further confirmed for some subsets of candidates by Western blot analysis using specific antibodies. It is performed that semi-quantitative RT?CR with specific primer sets for gene products that are differentially regulated with G12V/T35S Ras expression. Taken together, results obtained and present here show that the comparative analysis of proteome from oncogenic H-Ras expressing cells has yielded interpretable data to elucidate the protein network directly and/or indirectly.
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