Human interleukin-12 (hIL-12)는 두 개의 구성요소인 p35와 p40이 disulfide bond를 이루어 p70의 형태로 존재하는 당 단백질로 interferon-γ의 생산을 자극하는 강력한 면역치료제로 널리 이용된다. 기존의 담배 세포 배양을 통해 생산 되어진 재조합 hIL-12 (rhIL-12)는 그 생산량이 배양 7일째 180.5ug/L로 매우 낮은 수준에 그치고 있다. 본 연구에서는 식물 세포 배양의 단점인 낮은 발현량을 높이고자 ...
Human interleukin-12 (hIL-12)는 두 개의 구성요소인 p35와 p40이 disulfide bond를 이루어 p70의 형태로 존재하는 당 단백질로 interferon-γ의 생산을 자극하는 강력한 면역치료제로 널리 이용된다. 기존의 담배 세포 배양을 통해 생산 되어진 재조합 hIL-12 (rhIL-12)는 그 생산량이 배양 7일째 180.5ug/L로 매우 낮은 수준에 그치고 있다. 본 연구에서는 식물 세포 배양의 단점인 낮은 발현량을 높이고자 sucrose starvation시 유전자의 발현이 대량으로 유도되는 특징을 가진 RAmy3D promoter 시스템을 이용하였다. RhIL-12의 p35와 p40 유전자를 각각 식물 발현 운반체에 cloning한 후 rice callus에 동시에 형질 전환 시켰다. 형질 전환된 rice callus에 식물 세포 현탁 배양체계를 확립하였고 두 개의 유전자가 발현되어 만들어진 생물학적 활성을 띤 p70형태의 rhIL-12가 액체 배지 내로 분비되는 것을 Western blot analysis와 생물학적 검정을 통하여 확인하였다. ELISA를 통하여 배지에 분비되는 rhIL-12양을 측정한 결과 13일째 가장 높은 농도인 1.3mg/L로 나타났으며, 그 후 배지에 축적되는 양이 서서히 감소함을 확인하였다. 배지 내에서 불안정한 rhIL-12을 위해 단백질 안정화에 효과가 있는 것으로 알려진 polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP) 와 gelatin 을 첨가하여 rhIL-12의 생산량을 향상시켰다. 그 중 gelatin 에서 가장 높은 안정화 (6.4mg/L)를 보였다. 강한 발현시스템인 RAmy3D promoter를 이용했을 때의 문제점은 탄소원인 sucrose가 결핍된 상태에서 단백질을 생산함으로써 rice callus의 생존율이 떨어진다는 것이다. 세포의 생존력을 유지하면서 생산량을 증가시키기 위한 방법으로 대체 탄소원인 pyruvic acid, malic acid, fumaric acid, succinic acid를 첨가시켰다. 그 결과 malic acid를 첨가한 배지에서 rhIL-12가 최고 15mg/L수준으로 발현하였다. 이러한 결과를 토대로 heterologous 단백질들을 식물 세포 배양을 통해 생물학적 활성을 지닌 형태로 분비, 대량 생산 할 수 있는 가능성을 본 연구에서 제시하였다.
Human interleukin-12 (hIL-12)는 두 개의 구성요소인 p35와 p40이 disulfide bond를 이루어 p70의 형태로 존재하는 당 단백질로 interferon-γ의 생산을 자극하는 강력한 면역치료제로 널리 이용된다. 기존의 담배 세포 배양을 통해 생산 되어진 재조합 hIL-12 (rhIL-12)는 그 생산량이 배양 7일째 180.5ug/L로 매우 낮은 수준에 그치고 있다. 본 연구에서는 식물 세포 배양의 단점인 낮은 발현량을 높이고자 sucrose starvation시 유전자의 발현이 대량으로 유도되는 특징을 가진 RAmy3D promoter 시스템을 이용하였다. RhIL-12의 p35와 p40 유전자를 각각 식물 발현 운반체에 cloning한 후 rice callus에 동시에 형질 전환 시켰다. 형질 전환된 rice callus에 식물 세포 현탁 배양체계를 확립하였고 두 개의 유전자가 발현되어 만들어진 생물학적 활성을 띤 p70형태의 rhIL-12가 액체 배지 내로 분비되는 것을 Western blot analysis와 생물학적 검정을 통하여 확인하였다. ELISA를 통하여 배지에 분비되는 rhIL-12양을 측정한 결과 13일째 가장 높은 농도인 1.3mg/L로 나타났으며, 그 후 배지에 축적되는 양이 서서히 감소함을 확인하였다. 배지 내에서 불안정한 rhIL-12을 위해 단백질 안정화에 효과가 있는 것으로 알려진 polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP) 와 gelatin 을 첨가하여 rhIL-12의 생산량을 향상시켰다. 그 중 gelatin 에서 가장 높은 안정화 (6.4mg/L)를 보였다. 강한 발현시스템인 RAmy3D promoter를 이용했을 때의 문제점은 탄소원인 sucrose가 결핍된 상태에서 단백질을 생산함으로써 rice callus의 생존율이 떨어진다는 것이다. 세포의 생존력을 유지하면서 생산량을 증가시키기 위한 방법으로 대체 탄소원인 pyruvic acid, malic acid, fumaric acid, succinic acid를 첨가시켰다. 그 결과 malic acid를 첨가한 배지에서 rhIL-12가 최고 15mg/L수준으로 발현하였다. 이러한 결과를 토대로 heterologous 단백질들을 식물 세포 배양을 통해 생물학적 활성을 지닌 형태로 분비, 대량 생산 할 수 있는 가능성을 본 연구에서 제시하였다.
Human interleukin 12 (hIL-12) is a heterodimeric cytokine composed of two disulphide-linked subunits p35 and p40, to form the biologically active p70 molecule. It is potent inducer of the pro-inflammatory cytokine that plays an essential role in the interactions between the innate and adaptive arms ...
Human interleukin 12 (hIL-12) is a heterodimeric cytokine composed of two disulphide-linked subunits p35 and p40, to form the biologically active p70 molecule. It is potent inducer of the pro-inflammatory cytokine that plays an essential role in the interactions between the innate and adaptive arms of immunity. We previously produced recombinant hIL-12(rhIL-12) using transformed tobacco cells in suspension cultures, and demonstrated that it was secreted into the culture medium in a bioactive form (Kwon et al., 2003). However, secreted rhIL-12 was detected a maximum concentration of 180.5g/L at day 7 after incubation. In this study, in order to improve the production of rhIL-12, rice alfa-amylase Amy3D promoter was used. The Ramy3D promoter was strongly expressed in rice cultured cells during sugar starvation. Complementary DNAs encoding p35 and p40 of rhIL-12 were introduced independently into the plant expression vector. Using particle bombardment-mediated transformation, p35 and p40 genes were co-transformed into the calli of rice (Oryza sativa L). Transgenic calli were induced for cell suspension culture. Northern blot analysis indicated the expression of the introduced rhIL-12 gene in rice callus. Also in plant cell suspension culture, Western blot analysis and biological activity assay confirmed that rhIL-12 was expressed and secreted into culture medium as a functionally active form. The amount of rhIL-12 accumulated in culture medium was measured by ELISA with a maximum level of 1.5mg/L at day 13 and dropped slowly. To stabilization of the secreted rhIL-12, three stabilizing polymers were tested, gelatin, polyethylene glycol (PEG) and polyvinylpyrrolidone (PVP). Gelatin was the most effective in stabilizing the secreted rhIL-12. Following the addition of 1% (w/v) gelatin, the maximum rhIL-12 concentration reached 6.4mg/L, a 5-fold increase over control. But drawback of this RAmy3D promoter system is that the cells produce the rhIL-12 without a carbon source. To improve rhIL-12 productivity in a continuous production system, alternative carbon sources such as pyruvic acid, fumaric acid, malic acid and succinic acid were added to induction medium (without sucrose). The accumulated rhIL-12 in the medium containing 80mM fumaric acid reached 15mg/L at 14 day by culture than that in the control medium. These results suggest that the multimeric heterologous proteins could be highly produced through plant cell suspension culture with RAmy3D promoter.
Human interleukin 12 (hIL-12) is a heterodimeric cytokine composed of two disulphide-linked subunits p35 and p40, to form the biologically active p70 molecule. It is potent inducer of the pro-inflammatory cytokine that plays an essential role in the interactions between the innate and adaptive arms of immunity. We previously produced recombinant hIL-12(rhIL-12) using transformed tobacco cells in suspension cultures, and demonstrated that it was secreted into the culture medium in a bioactive form (Kwon et al., 2003). However, secreted rhIL-12 was detected a maximum concentration of 180.5g/L at day 7 after incubation. In this study, in order to improve the production of rhIL-12, rice alfa-amylase Amy3D promoter was used. The Ramy3D promoter was strongly expressed in rice cultured cells during sugar starvation. Complementary DNAs encoding p35 and p40 of rhIL-12 were introduced independently into the plant expression vector. Using particle bombardment-mediated transformation, p35 and p40 genes were co-transformed into the calli of rice (Oryza sativa L). Transgenic calli were induced for cell suspension culture. Northern blot analysis indicated the expression of the introduced rhIL-12 gene in rice callus. Also in plant cell suspension culture, Western blot analysis and biological activity assay confirmed that rhIL-12 was expressed and secreted into culture medium as a functionally active form. The amount of rhIL-12 accumulated in culture medium was measured by ELISA with a maximum level of 1.5mg/L at day 13 and dropped slowly. To stabilization of the secreted rhIL-12, three stabilizing polymers were tested, gelatin, polyethylene glycol (PEG) and polyvinylpyrrolidone (PVP). Gelatin was the most effective in stabilizing the secreted rhIL-12. Following the addition of 1% (w/v) gelatin, the maximum rhIL-12 concentration reached 6.4mg/L, a 5-fold increase over control. But drawback of this RAmy3D promoter system is that the cells produce the rhIL-12 without a carbon source. To improve rhIL-12 productivity in a continuous production system, alternative carbon sources such as pyruvic acid, fumaric acid, malic acid and succinic acid were added to induction medium (without sucrose). The accumulated rhIL-12 in the medium containing 80mM fumaric acid reached 15mg/L at 14 day by culture than that in the control medium. These results suggest that the multimeric heterologous proteins could be highly produced through plant cell suspension culture with RAmy3D promoter.
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