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문제 정의
- 최근 식생활의 변화로 당뇨병 환자의 수가 급격하게 증가하여 WHO의 발표에 의하면 향 후 20-30년 내에 당뇨병 환자가 현재의 거의 2배 달할 것으로 예측하고 있으며, 세계 인슐린 사장은 연간 5% 이상 증가할 전망이라고 한다. 따라서 식물에서의 유전자재조합 인슐린 생산 기술 개발은 상업적 가치가 매우 클 것으로 예상되므로 이 논문에서는 우선적으로 식물에서 유전자재조합 인슐린의 생성 가능성을 확인하는 연구를 수행하였다.
- 또한 최근 식물체를 이용하여 의약용 단백질 생산이 경제적인 측면과 안정성 측면에서 매우 효과적임이 보고되고 있어 이를 이용한 분자농업이 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 인슐린 단백질을 식물 체에서 생산하기 위한 유전자 발현 construct를 설계하기 위한 실험으로서 식물발현용 preprominiinsulin construct를 제조하기 위한 단계적 실험을 수행하였다. 우선 proinsulin 이 무세포 식물 전사/번역시스템에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
가설 설정
- 4 Diagram and sequence representing the construction of the human preprominiinsulin expression plasmid. A. The PCR amplified human preprominiinsulin cDNA driven by 35S promoter, which was fused to C-terminus of RFP was ligated with plant expression pTRAkt vector. The diagram of human preprominiinsulin recombinant gene was showed as [N terminus → tobacco E2 signal peptide → B-peptide (1-29 AA) → AAK → A-peptide (1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C terminus].
- The PCR amplified human preproinsulin cDNA containing Xba1 and BamH1 restriction sites and pBluescript SK+ vector. C. Human preproinsulin was expressed in wheat germ extract for in vitro transcription/ translation. The S35 -labeded preproinsulin protein was extracted from in vitro transcription/translation reaction mixture and then was purified samples in SDS-PAGE after staining with coomassieblue (left), and was exposed to X-rayfilm (right)
제안 방법
- 우선 식물체에서 발현을 쉽게 확인하기 위하여 리포터 유전자인 red fluorescence protein (RFP)에 결합된 재조합 preprominiinsulin 상태의 construct를 도입시켜 형질 전환식물체를 제조하였다. BY-2 세포에 재조합 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 감염시켜 kanamycin이 함유된 고체 배지에서 배양하면서 형질전환 담배세포를 선별하였다. 이러한 선별 과정을 거쳐서 선발된 다수의 형질전환 BY-2 세포로부터 재조합 단백질을 분리하여 10% SDS-PAGE에서 분리한 후 N 말단 부분에 RFP 단백질이 연결되어 있으므로 트립신을 처리하지 않은 상태에서 인간 항인슐린 항체를 이용하여 western 분석을 수행하여 보았다.
- Preproinsulin이 식물의 발현 시스템에서 단백질로 발현된다는 것을 확인하였으므로 실제 식물에서 인간 인슐린 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 인슐린 재조합 construct 를 제조하였다. 인슐린은 [N 말단 → 소포체 targeting 시그널 펩타이드 → B-펩타이드 → 단백질 분해성 절단효소 부위 → C-펩타이드 → 단백질 분해성 절단효소 부위 → A-펩타이드 → C 말단]의 순서로 이루어져 있다.
- Promega의 transcription과 translation coupled (TNT®) wheat germ extract system을 사용하여 반응을 수행하였다.
- 2002), 4℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액 만을 취하였다. SDS-PAGE는 Bio-Rad사의 proteinIII를 사용하였으며 전기영동시 10% 혹은 12%의 separating gel과 5%의 stacking gel을 사용하여 1시간 30분간 실시하였다. 염색은 staining solution (0.
- ) wheat germ extract system을 사용하여 반응을 수행하였다. T3 RNA polymerase와 wheat germ extract를 사용하여 30℃에서 in vitro transcription/translation시켰으며 이 때 주형 DNA로 플라스미드 DNA 1㎍을 사용하였고 반응 후 생성되는 단백질은 35[S]-methionine (1000Ci/mmol)을 사용하여 radio-labelling 시켰다. 이 후 SDS-PAGE sample loading buffer와 섞어 곧바로 100℃에서 10분간 가열하여 SDS-PAGE를 수행하였다.
- in vitro TNT 시스템 분석용 preproinsulin 재조합 construct를 이용하여 in vitro 상에서 단백질 합성 여부를 조사하였다. 해당 construct는 full-length의 preproinsulin 유전자가 Xbal과 BamHl 제한효소 site에 삽입되어 T3 promoter의 조절을 받는 것으로 식물체 단백질 발현 시스템인 wheat germ extract와 동위원소(35 S)를 사용하여 30℃에서 90분 동안 in vitro TNT 분석을 수행하였다.
- )를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 이 cDNA 를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 각각의 유전자 특이적인 primer를 주문제조한 후 PCR 반응은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 과정을 20 cycles로 하였으며 1% (w/v) agarose gel 상에서 증폭된 밴드를 확인하였다.
- 단백질 발현 양상을 관찰하기 위해 단백질을 추출한 후 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 추출을 위해 마쇄한 시료 0.
- 따라서 B-펩타이드 C 말단에서 트립신에 의하여 절단이 이루어지도록 B-펩타이드의 Lys29 잔기 뒷부분과 A-펩타이드의 N 말달 부분의 Gly1 사이에 AAK (GCTGCTAAG) 의 염기서열을 첨가하였다. 또한 인간 재조합 인슐린 단백질의 정제를 용이하도록 만들기 위하여 His6-tag의 염기서열(CATCATCATCATCATCAT)을 첨가하였다.
- 1989). 따라서 preprominiinsulin의 시그널 펩타이드로는 PR-5 thaumatin-like 단백질의 N 말단 부위의 25개 아미노산 서열 부위(MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHA)를 RT-PCR로 증폭시켜 시그널 펩타이드로 사용하였다. 또한 생성된 단백질을 소포체 내에 높은 효율로 축적하여 인슐린 단백질을 합성할 수 있도록 최대화 하기 위하여 ER retention signal인 KDEL 서열을 추가하였으며, 그 사이에 트립신의 절단부위인 RR의 아미노산 잔기를 추가하였다.
- 따라서 이렇게 제조된 prominiinsulin 유전자의 construct를 pET-3a(+) 발현 벡터의 T7 프로모터 뒤의 제한효소 부위를 이용하여 결합시켜 대장균 발현용 인간 prominiinsulin 재조합 플라스미드를 제조하였다(Fig. 2B).
- 특히 C-펩타이드는 최근 연구 결과에 의하면 인슐린 합성 과정에서 파생되어 분비된 후 면역 반응이나 혹은 당뇨병 진전에 영향을 주는 요인으로 알려지면서 주목을 받기는 하지만 C-펩타이드는 인슐린 단백질의 구성 성분이 아니므로 C-펩타이드가 인슐린 단백질이 활성을 갖는데 참여하는 부위는 아니다(Pietropaolo 2013). 따라서 인슐린 재조합 단백질 construct에서 C-펩타이드 부위를 최소화시킨 miniinsulin을 제조하기로 하였다. 특히 C-펩타이드 부위가 제거된 miniinsulin이 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 것으로 보고된 내용을 참조하였다(Nykiforuk 2006; 공개특허 WO 10-2006-0052705).
- 또한 인간 재조합 인슐린 단백질의 정제를 용이하도록 만들기 위하여 His6-tag의 염기서열(CATCATCATCATCATCAT)을 첨가하였다. 또한 A 사슬과 His6-tag 사이에 Arg(R), Arg(R) dibasic processing site (AGAAGA)를 첨가함으로써 트립신 처리로 한번에 C-펩타이드와 KDEL 서열에 연결된 His6-tag까지 잘라내어 간단하게 인슐린 단백질을 정제할 수 있도록 하였다.
- 따라서 preprominiinsulin의 시그널 펩타이드로는 PR-5 thaumatin-like 단백질의 N 말단 부위의 25개 아미노산 서열 부위(MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHA)를 RT-PCR로 증폭시켜 시그널 펩타이드로 사용하였다. 또한 생성된 단백질을 소포체 내에 높은 효율로 축적하여 인슐린 단백질을 합성할 수 있도록 최대화 하기 위하여 ER retention signal인 KDEL 서열을 추가하였으며, 그 사이에 트립신의 절단부위인 RR의 아미노산 잔기를 추가하였다.
- 따라서 B-펩타이드 C 말단에서 트립신에 의하여 절단이 이루어지도록 B-펩타이드의 Lys29 잔기 뒷부분과 A-펩타이드의 N 말달 부분의 Gly1 사이에 AAK (GCTGCTAAG) 의 염기서열을 첨가하였다. 또한 인간 재조합 인슐린 단백질의 정제를 용이하도록 만들기 위하여 His6-tag의 염기서열(CATCATCATCATCATCAT)을 첨가하였다. 또한 A 사슬과 His6-tag 사이에 Arg(R), Arg(R) dibasic processing site (AGAAGA)를 첨가함으로써 트립신 처리로 한번에 C-펩타이드와 KDEL 서열에 연결된 His6-tag까지 잘라내어 간단하게 인슐린 단백질을 정제할 수 있도록 하였다.
- 해당 construct는 full-length의 preproinsulin 유전자가 Xbal과 BamHl 제한효소 site에 삽입되어 T3 promoter의 조절을 받는 것으로 식물체 단백질 발현 시스템인 wheat germ extract와 동위원소(35 S)를 사용하여 30℃에서 90분 동안 in vitro TNT 분석을 수행하였다. 반응이 끝난 산물들은 바로 12.5% SDS-PAGE 분석을 실시하였으며, BAS image analyzer를 이용하여 분자량이 약 12kDa인 preproinsulin 단백질을 확인하였다(Fig. 1C). 물론 아직 preproinsulin 단백질 상태이므로 insulin의 생리적 활성을 측정할 수는 없지만 인간의 preproinsulin 단백질이 식물체의 전사 및 해독을 통한 단백질 발현 시스템에서 단백질 합성이 성공적으로 이루어지는 것을 확인 할 수 있었다.
- 이후 MS 액체배지를 이용하여 Agrobacterim을 제거하고 100 mg/L kanamycin과 300 mg/L cefotaxim이 첨가된 BY-2 세포를 MS 고체 배지에 살포한 후 2 ~ 3주 동안 25℃에서 암 배양하였다. 배양 후 캘러스화 된 세포를 선별한 후 100 mg/L kanamycin이 첨가된 배지로 옮겨 2주 간격으로 계대배양 하면서 왕성하게 자라는 캘러스를 선별하였다. 이후 선별된 캘러스를 BY-2 세포의 MS 액체 배지에서 지속적으로 현탁 배양하였다.
- 앞의 과정을 거쳐 제조된 재조합 pET::prominiinsulin이 들어간 재조합 유전자 플라스미드를 도입하기 위하여 E. coli BL21에 형질전환 후 LB 배지에서 ampicillin과 0.4 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 대장균 세포를 배양한 후 대장균 lysate로부터 인간 재조합 miniinsulin 단백질을 분리한 후 His tag 컬럼을 통과하여 재조합 His-tagged prominiinsulin 단백질을 분리한 후 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 그 결과 7.
- SDS-PAGE는 Bio-Rad사의 proteinIII를 사용하였으며 전기영동시 10% 혹은 12%의 separating gel과 5%의 stacking gel을 사용하여 1시간 30분간 실시하였다. 염색은 staining solution (0.5% coomassie blue R-250, 40% methanol, 10% acetic acid)에서 3시간 염색 후 destaining solution (40% methanol, 10% acetic acid)에서 탈색하여 밴드의 양상을 분석하였다.
- 재조합 preprominiinsulin 단백질 발현을 위한 형질전환 담배식물체를 제조하기 위하여 앞에서 제조된 재조합 construct 를 담배현택배양세포인 BY-2 세포에 도입시켜 형질전환 하였다. 우선 식물체에서 발현을 쉽게 확인하기 위하여 리포터 유전자인 red fluorescence protein (RFP)에 결합된 재조합 preprominiinsulin 상태의 construct를 도입시켜 형질 전환식물체를 제조하였다. BY-2 세포에 재조합 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 감염시켜 kanamycin이 함유된 고체 배지에서 배양하면서 형질전환 담배세포를 선별하였다.
- 제조된 각각의 primer를 이용하여 Human Pancreas QUICK-Clone cDNA library (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 구입하여 주형으로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하였다. 이 결과 예상된 DNA 크기의 345 bp의 PCR 산물을 확인하고 최종적으로 염기서열분석을 의뢰하여 인간 preproinsulin 유전자를 획득하였다.
- Fisher 박사와의 논의를 거쳐 35S 프로모터의 발현효율을 더 향상시킨 변형 35S 프로모터를 갖고 있는 식물발현용 pTRAkt vector를 분양 받아 사용하였다. 이 벡터를 이용하여 앞에서 설계된 재조합 preprominiinsulin의 construct를 ligation하여 식물세포 발현용 construct를 제조하였다(Fig. 4A). 이의 유전자 구성은 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드(1-29 AA) → AAK → A-펩타이드(1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단]으로 이루어져 있다(Fig.
- BY-2 세포에 재조합 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 감염시켜 kanamycin이 함유된 고체 배지에서 배양하면서 형질전환 담배세포를 선별하였다. 이러한 선별 과정을 거쳐서 선발된 다수의 형질전환 BY-2 세포로부터 재조합 단백질을 분리하여 10% SDS-PAGE에서 분리한 후 N 말단 부분에 RFP 단백질이 연결되어 있으므로 트립신을 처리하지 않은 상태에서 인간 항인슐린 항체를 이용하여 western 분석을 수행하여 보았다.
- 이렇게 생성된 prominiinsulin에 존재하는 trypsin 절단부위가 정확하게 절단되어 A-펩타이드와 B-펩타이드로 나뉘어 인슐린의 활성을 갖게 되는가를 조사하기 위하여 트립신의 농도를 높여가면서 단백질 패턴을 알아보기 위한 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 이 결과에서 보면 lane 1에서 보여지는 His-tag 컬럼에 의해 분리된 재조합 miniinsulin 단백질이 7.
- 이를 좀 더 확인하기 위하여 인간 인슐린에 대한 monoclonal antibody (ab9569; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 활용하여 western 분석을 수행하였다. 특히 이 연구에서 사용한 인간 항인슐린 항체는 proinsulin은 인지하지 않는 것이 특징이다.
- 1% Tween 20이 첨가된 TBS buffer로 세척한 후 peroxidase-labeled secondary antibody (sc-2005; SANTA CRUZ)를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 반응한 후 다시 세척하였다. 이후 nitrocelluoase membrane을 West-ZOL Ⓡ (plus) Western Blot Detection System을 이용하여 X-ray 필름에 exposure 한 후 검출된 인슐린 단백질을 확인하였다.
- 4 mM IPTG를 첨가하여 3 ~ 4시간 더 배양하여 인슐린 단백질이 과발현 되도록 유도하였다. 이후 배양액을 4℃, 15,000 rpm에서 2분간 harvest하여 얻은 pellet을 멸균 수에 녹여 10% 혹은 12% SDS-PAGE를 통해 단백질 발현 정도를 확인하였다.
- 이를 원심분리하여 균주 세포를 수거한 후 lysozyme을 함유한 용액을 첨가하여 균주세포를 용해시킨 다음 CsCl과 EtBr를 첨가하여 고속원심분리(50,000 rpm, 16시간)시킨 후 DNA 플라스미드를 분리한 후 EtBr을 제거하였다. 이후 에탄올 침전 방법을 사용하여 깨끗한 DNA 플라스미드를 회수하였다.
- 그 결과 2,728 bp의 vector 단편과 345 bp의 insert (human preproinsulin) 단편을 획득하여 construct의 재조합 유무를 확인하였으며 최종적으로 염기서열분석을 통하여 확인하였다. 이후 이 인간 preproinsulin 유전자를 이용하여 식물 유래의 인간 인슐린을 생산할 수 있는 발현시스템을 탐색하기 위하여 우선 식물 시스템을 이용하여 in vitro 발현용 재조합된 preproinsulin construct 제조를 완성하였다(Fig. 1B).
-
인간 preproinsulin 유전자(GenBank X70508) 분리 및 무세포 식물 전사/번역시스템에서의 단백질 발현 확인
인간 preproinsulin 유전자를 분리하기 위하여 NCBI GenBank X70508의 염기서열을 바탕으로 BamHl 제한효소 site를 포함한 forward 방향 primer와 Sacl 제한효소 site를 포함한 reverse 방향 primer를 주문 제조하였다(Fig. 1A). 제조된 각각의 primer를 이용하여 Human Pancreas QUICK-Clone cDNA library (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 구입하여 주형으로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하였다.
- 인간 인슐린 유전자를 분리하기 위하여 Human Pancreas QUICK-Clone cDNA library (Clontech)를 구입하여 주형으로 이용하여 RT-PCR을 수행하였으며, 담배 식물체의 ERtargeting signal peptide는 담배 식물체에서 분리한 total RNA 1 μg을 reverse transcriptase (High Fidelity RNA PCR Kit, Takara Bio Inc.)를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 이 cDNA 를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.
- 인슐린 유전자의 단백질 발현을 확인하기 위하여 박테리아 발현 벡터인 pET-3a(+)의 NdeI과 BamHI 사이에 miniproinsulin (B-chain+AAK+A-chain+RR+His6)을 삽입하여 재조합시킨 후 E.coli BL21(ED3) 균주에 형질전환 하였다. 37℃에서 OD 600에서 0.
- 재조합 preprominiinsulin 단백질 발현을 위한 형질전환 담배식물체를 제조하기 위하여 앞에서 제조된 재조합 construct 를 담배현택배양세포인 BY-2 세포에 도입시켜 형질전환 하였다. 우선 식물체에서 발현을 쉽게 확인하기 위하여 리포터 유전자인 red fluorescence protein (RFP)에 결합된 재조합 preprominiinsulin 상태의 construct를 도입시켜 형질 전환식물체를 제조하였다.
- 1A). 제조된 각각의 primer를 이용하여 Human Pancreas QUICK-Clone cDNA library (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 구입하여 주형으로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하였다. 이 결과 예상된 DNA 크기의 345 bp의 PCR 산물을 확인하고 최종적으로 염기서열분석을 의뢰하여 인간 preproinsulin 유전자를 획득하였다.
- in vitro TNT 시스템 분석용 preproinsulin 재조합 construct를 이용하여 in vitro 상에서 단백질 합성 여부를 조사하였다. 해당 construct는 full-length의 preproinsulin 유전자가 Xbal과 BamHl 제한효소 site에 삽입되어 T3 promoter의 조절을 받는 것으로 식물체 단백질 발현 시스템인 wheat germ extract와 동위원소(35 S)를 사용하여 30℃에서 90분 동안 in vitro TNT 분석을 수행하였다. 반응이 끝난 산물들은 바로 12.
- 획득된 인간 preproinsulin 유전자는 BamHl과 Sacl 제한 효소 site를 포함하고 있으므로 transit peptide를 결합한 in vivo 발현용 construct 제조가 용이하도록 T&A cloning vector (RBC Bioscience)에 먼저 ligation 하였다.
대상 데이터
- 식물에서 고효율로 발현되는 의약용 단백질을 생산하기 위한 식물세포용 프로모터로는 독일 프라운호퍼 연구소 소장인 R. Fisher 박사와의 논의를 거쳐 35S 프로모터의 발현효율을 더 향상시킨 변형 35S 프로모터를 갖고 있는 식물발현용 pTRAkt vector를 분양 받아 사용하였다. 이 벡터를 이용하여 앞에서 설계된 재조합 preprominiinsulin의 construct를 ligation하여 식물세포 발현용 construct를 제조하였다(Fig.
- 인슐린 유전자가 도입된 형질전환 담배 배양세포를 4일 동안 배양하여 western blot 분석을 위한 재료로 사용하였다. 약 0.
- 따라서 인슐린 재조합 단백질 construct에서 C-펩타이드 부위를 최소화시킨 miniinsulin을 제조하기로 하였다. 특히 C-펩타이드 부위가 제거된 miniinsulin이 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 것으로 보고된 내용을 참조하였다(Nykiforuk 2006; 공개특허 WO 10-2006-0052705).
데이터처리
- 이렇게 제조한 인간 prominiinsulin이 대장균에서 발현될 수 있는 codon usage를 이용하여 발현 수준을 분석해 주는 값인 Codon Adaptation Index (CAI) 값을 분석사이트 (GenScript Rare Codon Analysis Tool, CAI calculator)를 이용하여 분석하였다(Puigbὸ et al.2008) (Fig. 2A). 보정된 CAI 값을 보면 일반적으로 0.
이론/모형
- CsCl-EtBr density gradient를 이용한 방법을 사용하였다(Sambrook et al. 2001). DNA construct를 함유한 균주를 항생제(ampicillin)가 들어 있는 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양하여 단일 균주를 선발한 후 항생제가 들어 있는 LB 액체배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 이상 진탕 배양하였다.
성능/효과
- 우선 proinsulin 이 무세포 식물 전사/번역시스템에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다. Prominiinsulin construct를 제조하여 대장 균에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 트립신으로 절단한 후 인간 항인슐린 항체를 이용한 western 분석을 통하여 효과적으로 A-펩타이드와 B-펩타이드가 형성되며 이후 적절하게 접힘이 일어나고 hexamer로 조립됨을 확인하였다. 이후 식물체에서 재조합 인슐린 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여 RFP 결합 construct를 제조 하여 담배의 현탁배양세포인 BY-2 세포에 형질전환시켜 RFP 결합 preprominiinsulin이 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
- 획득된 인간 preproinsulin 유전자는 BamHl과 Sacl 제한 효소 site를 포함하고 있으므로 transit peptide를 결합한 in vivo 발현용 construct 제조가 용이하도록 T&A cloning vector (RBC Bioscience)에 먼저 ligation 하였다. 그 결과 2,728 bp의 vector 단편과 345 bp의 insert (human preproinsulin) 단편을 획득하여 construct의 재조합 유무를 확인하였으며 최종적으로 염기서열분석을 통하여 확인하였다. 이후 이 인간 preproinsulin 유전자를 이용하여 식물 유래의 인간 인슐린을 생산할 수 있는 발현시스템을 탐색하기 위하여 우선 식물 시스템을 이용하여 in vitro 발현용 재조합된 preproinsulin construct 제조를 완성하였다(Fig.
- 4 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 대장균 세포를 배양한 후 대장균 lysate로부터 인간 재조합 miniinsulin 단백질을 분리한 후 His tag 컬럼을 통과하여 재조합 His-tagged prominiinsulin 단백질을 분리한 후 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 그 결과 7.8 kDa 크기의 prominiinsulin 을 얻은 것으로 보아 full-length의 prominiinsulin 단백질이 성공적으로 합성된 것으로 여겨진다(Fig. 3A, lane 1).
- 그 결과에서 보면 인슐린 항체가 인지한 단백질의 크기는 약 40 kDa 부근에서 나타났는데 이는 RFP 단백질의 크기가 27 kDa이며 preprominiinsulin의 크기가 10.7 kDa 이므로 RFP와 preprominiinsulin이 연결되어 발현된 총 37 kDa 크기의 재조합 단백질이 성공적으로 발현된 것으로 확인되었다. 실제로 이 연구에서 사용한 인간 항인슐린 monoclonal 항체는 processing이 적절하게 되어 활성을 갖는 인슐린만을 인지하는 항체인 것으로 보고되었지만 트립신을 처리하지 않았음에도 불구하고 RFP::preprominiinsulin을 인지하였는데 이는 RFP가 결합하여 preprominiinsulin의 3차구조에 영향을 주어 항체에 의해 인지된 것으로 여겨진다.
- 따라서 이 25 kDa 의 밴드는 A-펩타이드와 B-펩타이드로 절단된 후 이황화다리가 형성되어 monomer로 완성된 후 저장형태의 인슐린이 되기 위하여 hexamer로 조립되는데 바로 이렇게 형성된 hexamer 인 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 설계되어 in vitro 시스템에서 발현된 재조합된 proinsumin 이 된 다음 트립신에 의해 효과적으로 절단되어 인슐린으로 전환되었음을 확인할 수 있었다.
- 1C). 물론 아직 preproinsulin 단백질 상태이므로 insulin의 생리적 활성을 측정할 수는 없지만 인간의 preproinsulin 단백질이 식물체의 전사 및 해독을 통한 단백질 발현 시스템에서 단백질 합성이 성공적으로 이루어지는 것을 확인 할 수 있었다.
- 2A). 보정된 CAI 값을 보면 일반적으로 0.8 이상이면 발현 수율이 높은 것으로 나타내는데 본 연구에서 재조합한 인간 prominiinsulin 은 대장균, 담배 식물체 모두에서 높은 CAI 값을 갖는 것으로 나타났으므로 재조합된 인간 prominiinsulin의 염기 서열은 대장균과 담배 식물체에서 발현이 용이한 것으로 분석되었다.
- 본 연구에서는 인슐린 단백질을 식물 체에서 생산하기 위한 유전자 발현 construct를 설계하기 위한 실험으로서 식물발현용 preprominiinsulin construct를 제조하기 위한 단계적 실험을 수행하였다. 우선 proinsulin 이 무세포 식물 전사/번역시스템에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다. Prominiinsulin construct를 제조하여 대장 균에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 트립신으로 절단한 후 인간 항인슐린 항체를 이용한 western 분석을 통하여 효과적으로 A-펩타이드와 B-펩타이드가 형성되며 이후 적절하게 접힘이 일어나고 hexamer로 조립됨을 확인하였다.
- 이렇게 생성된 prominiinsulin에 존재하는 trypsin 절단부위가 정확하게 절단되어 A-펩타이드와 B-펩타이드로 나뉘어 인슐린의 활성을 갖게 되는가를 조사하기 위하여 트립신의 농도를 높여가면서 단백질 패턴을 알아보기 위한 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 이 결과에서 보면 lane 1에서 보여지는 His-tag 컬럼에 의해 분리된 재조합 miniinsulin 단백질이 7.8 kDa 부위에서 관찰되었지만 트립신의 농도를 높여갈수록 7.8 kDa의 밴드의 양은 감소하면서 약 25 kDa의 부위의 밴드의 양은 증가하였다. 또한 2.
- 3 kDa 크기의 B-펩타이드의 밴드의 양도 증가하였다. 이는 이 연구에서 설계되어 재조합된 인간 prominiinsulin이 적절하게 트립신에 잘려서 인슐린 단백질로 전환됨을 확인할 수 있었다. 그러나 A-펩타이드와 B-펩타이드가 이황화다리로 연결되어 3차구조를 형성하여 monomer가 된다면 약 6 kDa의 밴드가 증가하여야 함에도 불구하고 이보다 훨씬 큰 크기로서 약 25 kDa 밴드가 증가하였다.
- 이상의 연구 결과에서 prominiinsulin이 식물체에서 발현되고, 또한 트립신에 의해 A-펩타이드와 B-펩타이드로 절단되며, 이후 효과적으로 접힘이 일어나며, 이어서 인슐린의 저장형태인 hexamer로까지 조립됨을 확인하게 되었다. 이는 본 논문에서 설계된 preprominiinsulin이 식물 세포에서 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 형태로 접힘과 조립이 가능한 것으로 판단되었기 때문에 향 후 식물을 이용한 분자농업용 인슐린 생산용 재조합 유전자로 활용할 수 있을 것으로 여겨진다.
- Prominiinsulin construct를 제조하여 대장 균에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 트립신으로 절단한 후 인간 항인슐린 항체를 이용한 western 분석을 통하여 효과적으로 A-펩타이드와 B-펩타이드가 형성되며 이후 적절하게 접힘이 일어나고 hexamer로 조립됨을 확인하였다. 이후 식물체에서 재조합 인슐린 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여 RFP 결합 construct를 제조 하여 담배의 현탁배양세포인 BY-2 세포에 형질전환시켜 RFP 결합 preprominiinsulin이 성공적으로 발현됨을 확인하였다. 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향 후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드(1-29 AA) → AAK → A-펩타이드(1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.
후속연구
- 그러나, BY-2 세포에서의 재조합 인슐린 유전자를 도입시켜 발현시킨 목적은 담배 식물체에서 재조합 인슐린이 발현되는가를 확인해보기 위한 것이었으므로 재조합 인슐린 DNA가 제대로 발현됨을 확인한 것은 다음 단계로 진행할 수 있는 토대가 될 수 있어 의미가 있는 연구라고 판단된다.
- 이상의 연구 결과에서 prominiinsulin이 식물체에서 발현되고, 또한 트립신에 의해 A-펩타이드와 B-펩타이드로 절단되며, 이후 효과적으로 접힘이 일어나며, 이어서 인슐린의 저장형태인 hexamer로까지 조립됨을 확인하게 되었다. 이는 본 논문에서 설계된 preprominiinsulin이 식물 세포에서 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 형태로 접힘과 조립이 가능한 것으로 판단되었기 때문에 향 후 식물을 이용한 분자농업용 인슐린 생산용 재조합 유전자로 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향 후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하고 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드(1-29 AA) → AAK → A-펩타이드(1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자 농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.
- 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향 후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하고 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드(1-29 AA) → AAK → A-펩타이드(1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자 농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.
- 이후 식물체에서 재조합 인슐린 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여 RFP 결합 construct를 제조 하여 담배의 현탁배양세포인 BY-2 세포에 형질전환시켜 RFP 결합 preprominiinsulin이 성공적으로 발현됨을 확인하였다. 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향 후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드(1-29 AA) → AAK → A-펩타이드(1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.
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