C형 간염바이러스 (Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviride속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로 non-A, non-B 간염을 일으키고, 만성으로 진행될 경우 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 현재까지 유일한 치료방법인 α-interferon을 이용한 방법과 ribavirin을 동시에 투여하는 방법이 있지만 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 효과를 보이고 있으며 많은 부작용을 유발한다. 따라서, 이 바이러스에 대한 효과적인 치료제의 개발이 필요하다. HCV가 숙주에 감염하게 되면 strain간에 매우 보존되어 있는 internal ribosomal ...
C형 간염바이러스 (Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviride속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로 non-A, non-B 간염을 일으키고, 만성으로 진행될 경우 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 현재까지 유일한 치료방법인 α-interferon을 이용한 방법과 ribavirin을 동시에 투여하는 방법이 있지만 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 효과를 보이고 있으며 많은 부작용을 유발한다. 따라서, 이 바이러스에 대한 효과적인 치료제의 개발이 필요하다. HCV가 숙주에 감염하게 되면 strain간에 매우 보존되어 있는 internal ribosomal entry site (IRES)라는 특이한 구조를 매개로 번역 반응이 일어나서 하나의 긴 복합 단백질을 형성하게 된다. 이러한 복합 단백질은 세포내의 protease와 HCV NS3 protease에 의해 각 특정부위가 잘려져 개개의 기능을 갖는 단백질이 형성된다. 그 중 HCV의 NS5B는 RNA dependent RNA polymerase의 활성을 가지고 있어 바이러스 복제에 중요한 역할을 하며 여러 strain에 매우 보존되어져 있다. 따라서 strain간에 매우 보존되어 있는 IRES와 NS5B모두 HCV 치료를 위한 좋은 표적으로 작용할 수 있다. 본 논문에서는 HCV의 NS5B에 의해 그 활성이 조절되는 HCV IRES 표적 allosteric hammerhead ribozyme(NS5B dependent aptazyme)을 개발하고자 한다. HCV NS5B protein에 활성이 조절되는 aptazyme을 개발하기 위해 random self-cleaving aptazyme pool을 SELEX방법을 이용하여 NS5B aptamer와 NS5B protein의 binding energy를hammerhead ribozyme의 활성화 구조로 변화 시켜줄 수 있는 communication module을 선별하였다. 이렇게 선별된 self-cleaving aptazymes을 이용하여 NS5B 농도별 활성과 시간별 활성을 조사함으로써 aptazyme의 활성이 NS5B 의존적임을 검증하였다. 검증된 self-cleaving aptazyme을 이용하여 HCV IRES targeting trans-cleaving aptazyme으로의 활성을 검증해 본 결과, 선별된 aptazyme들이 trans-cleavage 활성은 없음을 확인하였다. 이렇게 선별된 self-cleaving aptazymes은 HCV diagnostic sensor로서 활용할 수 있을 것이며, trans-cleavage 활성이 없기 때문에 직접적인 IRES 표적은 할 수 없지만, cleavage되어져 나오는 fragment에 HCV replication을 저해할 수 있는 sequence를 삽입함으로써 항HCV 제제로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
C형 간염바이러스 (Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviride속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로 non-A, non-B 간염을 일으키고, 만성으로 진행될 경우 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 현재까지 유일한 치료방법인 α-interferon을 이용한 방법과 ribavirin을 동시에 투여하는 방법이 있지만 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 효과를 보이고 있으며 많은 부작용을 유발한다. 따라서, 이 바이러스에 대한 효과적인 치료제의 개발이 필요하다. HCV가 숙주에 감염하게 되면 strain간에 매우 보존되어 있는 internal ribosomal entry site (IRES)라는 특이한 구조를 매개로 번역 반응이 일어나서 하나의 긴 복합 단백질을 형성하게 된다. 이러한 복합 단백질은 세포내의 protease와 HCV NS3 protease에 의해 각 특정부위가 잘려져 개개의 기능을 갖는 단백질이 형성된다. 그 중 HCV의 NS5B는 RNA dependent RNA polymerase의 활성을 가지고 있어 바이러스 복제에 중요한 역할을 하며 여러 strain에 매우 보존되어져 있다. 따라서 strain간에 매우 보존되어 있는 IRES와 NS5B모두 HCV 치료를 위한 좋은 표적으로 작용할 수 있다. 본 논문에서는 HCV의 NS5B에 의해 그 활성이 조절되는 HCV IRES 표적 allosteric hammerhead ribozyme(NS5B dependent aptazyme)을 개발하고자 한다. HCV NS5B protein에 활성이 조절되는 aptazyme을 개발하기 위해 random self-cleaving aptazyme pool을 SELEX방법을 이용하여 NS5B aptamer와 NS5B protein의 binding energy를hammerhead ribozyme의 활성화 구조로 변화 시켜줄 수 있는 communication module을 선별하였다. 이렇게 선별된 self-cleaving aptazymes을 이용하여 NS5B 농도별 활성과 시간별 활성을 조사함으로써 aptazyme의 활성이 NS5B 의존적임을 검증하였다. 검증된 self-cleaving aptazyme을 이용하여 HCV IRES targeting trans-cleaving aptazyme으로의 활성을 검증해 본 결과, 선별된 aptazyme들이 trans-cleavage 활성은 없음을 확인하였다. 이렇게 선별된 self-cleaving aptazymes은 HCV diagnostic sensor로서 활용할 수 있을 것이며, trans-cleavage 활성이 없기 때문에 직접적인 IRES 표적은 할 수 없지만, cleavage되어져 나오는 fragment에 HCV replication을 저해할 수 있는 sequence를 삽입함으로써 항HCV 제제로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
Hepatitis C virus (HCV) is the main etiological agent of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Although the HCV infection causes worldwide health problem, efficient and specific antiviral therapy has not yet been developed. Since the RNA dependent RNA polymerase (NS5B) of ...
Hepatitis C virus (HCV) is the main etiological agent of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Although the HCV infection causes worldwide health problem, efficient and specific antiviral therapy has not yet been developed. Since the RNA dependent RNA polymerase (NS5B) of HCV plays a central role in the viral replication and highly conserved Internal ribosomal entry site (IRES) of HCV plays a central role in viral protein translation, both are good targets for anti-HCV agents. I developed HCV IRES-targeting hammerhead ribozyme which activity is alloterically regulated by HCV NS5B protein. To develop NS5B-dependent allosteric hammerhead ribozyme (aptazyme), I performed in-vitro selection to identify communication module that can deliver configuration change of NS5B aptamer via binding of NS5B to induce ribozyme activity. The NS5B-dependent aptazyme is activated only in the presence of HCV NS5B protein and specifically cleaved target region. To further characterization, we performed protein and time dependent in-vitro self-cleavage assay. Through these assay, we confirmed specificity and efficiency of NS5B dependent aptazyme. I speculate that these NS5B dependent aptazmes are used as a new HCV theraputic and diagnostic tool in addition to studying HCv replication mechanism.
Hepatitis C virus (HCV) is the main etiological agent of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Although the HCV infection causes worldwide health problem, efficient and specific antiviral therapy has not yet been developed. Since the RNA dependent RNA polymerase (NS5B) of HCV plays a central role in the viral replication and highly conserved Internal ribosomal entry site (IRES) of HCV plays a central role in viral protein translation, both are good targets for anti-HCV agents. I developed HCV IRES-targeting hammerhead ribozyme which activity is alloterically regulated by HCV NS5B protein. To develop NS5B-dependent allosteric hammerhead ribozyme (aptazyme), I performed in-vitro selection to identify communication module that can deliver configuration change of NS5B aptamer via binding of NS5B to induce ribozyme activity. The NS5B-dependent aptazyme is activated only in the presence of HCV NS5B protein and specifically cleaved target region. To further characterization, we performed protein and time dependent in-vitro self-cleavage assay. Through these assay, we confirmed specificity and efficiency of NS5B dependent aptazyme. I speculate that these NS5B dependent aptazmes are used as a new HCV theraputic and diagnostic tool in addition to studying HCv replication mechanism.
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