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문제 정의
- 본 연구에서는 aptamer의 가역적인 표적 분자 인지를 통한 표적 분자의 활성 억제 능력을 frara-splicing 리보자임의 비가역적인 표적 RNA 치환 능력과 결합한 새로운 개념의 항 HCV 억제제를 개발하고자 하였다. 특히 fran.
- 개발하고자 하였다. 특히 fran.s-splicing 리보자임의 활성이 특정 리간드가 aptamer와 결합하여야지만 allosteric하게 유도될 수 있는 즉 리간드가 있는 경우에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 Jrans-splicing aptazyme을 개발하고자 하였다(Fig. 1). 이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다.
제안 방법
- 과.연 이러한 "splicing 산물이 정확한 mwsplicing 반응에 의해 생성된 산물인지 검증하기 위하여 획득한 trans-sphcing RT-PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 산물들 간의 염기 서열이 서로 다른지 알기 위하여 PCR 산물을 비로 qwig하지 않고 pUC19 vector에 cloning 한 후 clone 20개를 얻은 후 각 clone들의 염기서열을 결정하였다(Fig.
- 본 과제에서는 aptamer와 theophylline 결합에 의해 리보자임 활성을 induce 시키는데 관여하는 communication module (13)을 이용하였다, 세 번째 modulee HCV IRES 내에서 리보자임에 대한 가장 적합한 부위인 +199 부위를 인지하여 새로운 RNA로 치환할 수 있는 mms-splicing 리보자임 부위(21)이다. RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다. 결론적으로 wild-type 리보자임 (WT), WT의 P6, P8 또는 P6과 P8에 aptamer와 communication module sequence/} 부착된 리보자임(각각 WT-P6H, WT-P8H, WT-P6HP8H) 등 4가지 리보자임을 제작하였다(Fig.
- 0, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2, 100 μM guanosine) 하에서 37℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. Splicing 반응시에 물 또는 0.5 mM caffeine (theophylline 구조 유사체로서 allosteric 효과의 특이성에 대한 대조군), 또는 0.5 mM theophylline과 함께 반응시킴으로써 mms-splicing 반응이 theophylline 특이적으로 allosteric하게 유도되는지 관찰하였다. 이때 RT를 위한 primer는 luciferase 인지부위 (5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGA TAA)이며 PCR을 위한 51 primer는 기질 RNA의 5' end(5'-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT)를, 3' primer는 luciferase 를 인지하는 부위(*CCCAAGCTTTCACTGCAIACGA CGAIT) 를 이용하였다.
- aptamoi.가 결합하는 theophylline과 함께, 또는 대조 리간드로서 caffeine과 함께 반응 후 rrane-splicing 산물 형성 여부를 관찰하였다. Caffeine의 구조는 theophylline] N-7 부위에 메틸기가 첨가된 물질로서 theophylline의 구조와 매우 유사하다.
- 반면 P6b stem-loop 구조는 다른 hairpin 구조로 치환하여도 효소 활성에는 변화가 없다고 알려져 있다. 따라서 P6b의 tetraloop receptor 부위 바로 아래에 존재하는 stem-loop 구조에 theophylline aptamei와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P6H)을 제작하여 과연 theophylline0] 존재해야지만 allosteric하게 group I intron의 구조가 변형되어 fra/15-splicing 기능이 유도되는지 관찰하였다(Fig. 2B). 또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다.
- 2B). 또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다. 대조군으로는 wild type Tetrahymena group I intron의 P6 P8 도메인을 갖고 있는 mwsplicing 리보자임(WT)을 이용하였다(Fig.
- luci)를 삽입한 aptazyme construct들을 제조하였다. 리보자임 제작을 위해 우선 WT 리보자임 벡터를 기질로 한 후 overlapping PCR 방법을 이용하여 각 aptazyme 벡터를 제작한 후 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 각 리보자임 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
- 리보자임(50 nM)과 기질 RNA (10 nM)< splicing 조건(50 mM HEPES; pH 7.0, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2, 100 μM guanosine) 하에서 37℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. Splicing 반응시에 물 또는 0.
- 리보자임의 표적 RNA를 제작하기 위하여 HCV lb 타입의 IRES RNA의 +18 nucleotide (nt) 부위부터 +402 nt 부위까지 포함되어 있는 DNA [pH(18-402)CAT] 벡터를 HCV 유전체의 +402 부위를 인지하는 HI으로 절단하였다. 선향화한 DNA 벡터를 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37。에서 3 시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 표적 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
- PCRe denaturation 96℃ 5분, annealing 60℃ 30초, extension 72℃ 30초로 22 cycle 동안 수행하였다. 반응이 끝난 RT-PCR 산물은 3% agarose gel 상에서 전기영동하여 분석하였다.
- 두 번째 modulee aptamer 의 ligand 결합에 의한 구조적 변이를 리보자임의 구조적 변이로전환시키는데 관여하는 communication module이다. 본 과제에서는 aptamer와 theophylline 결합에 의해 리보자임 활성을 induce 시키는데 관여하는 communication module (13)을 이용하였다, 세 번째 modulee HCV IRES 내에서 리보자임에 대한 가장 적합한 부위인 +199 부위를 인지하여 새로운 RNA로 치환할 수 있는 mms-splicing 리보자임 부위(21)이다. RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다.
- 이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다. 본 연구에선 모델 시스템으로 theophylline에 대한 특이적인 aptamer와 aptamer-리간드의 결합에 의해 allosteric하게 리보자임의 활성을증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 Tetrahymena group I intron의 여러 catalytic 도메인에 삽입한 후 그 활성을 탐색하였다.
- 연 이러한 "splicing 산물이 정확한 mwsplicing 반응에 의해 생성된 산물인지 검증하기 위하여 획득한 trans-sphcing RT-PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 산물들 간의 염기 서열이 서로 다른지 알기 위하여 PCR 산물을 비로 qwig하지 않고 pUC19 vector에 cloning 한 후 clone 20개를 얻은 후 각 clone들의 염기서열을 결정하였다(Fig. 4). 그림과 같이 msplicing 반응 산물을 sequencing 한 결과 모두 기질 RNA의 표적 부위 다음과 리보자임의 3* exon에 부착된 firefly luciferase RNA가 정확히 접합된 산물이었으며 이러한 결과는 trans-splicing aptazyme 의 반응이 매우 정확히 일어남을 시사한다.
- 5 mM theophylline과 함께 반응시킴으로써 mms-splicing 반응이 theophylline 특이적으로 allosteric하게 유도되는지 관찰하였다. 이때 RT를 위한 primer는 luciferase 인지부위 (5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGA TAA)이며 PCR을 위한 51 primer는 기질 RNA의 5' end(5'-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT)를, 3' primer는 luciferase 를 인지하는 부위(*CCCAAGCTTTCACTGCAIACGA CGAIT) 를 이용하였다. PCRe denaturation 96℃ 5분, annealing 60℃ 30초, extension 72℃ 30초로 22 cycle 동안 수행하였다.
- 1). 이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다. 본 연구에선 모델 시스템으로 theophylline에 대한 특이적인 aptamer와 aptamer-리간드의 결합에 의해 allosteric하게 리보자임의 활성을증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 Tetrahymena group I intron의 여러 catalytic 도메인에 삽입한 후 그 활성을 탐색하였다.
- 2B). 제작한 aptazyme들의 transsplicing 기능을 검증하기 위하여 리보자임의 3' exon에 firefly luciferase (F.luci)를 삽입한 aptazyme construct들을 제조하였다. 리보자임 제작을 위해 우선 WT 리보자임 벡터를 기질로 한 후 overlapping PCR 방법을 이용하여 각 aptazyme 벡터를 제작한 후 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 각 리보자임 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
- 제작한 리보자임 RNA와 기질 RNA를 우선 95, C에서 1분 30 초 동안 변성시킨 후 37C에서 15분 동안 반응시켜 구조를 재형성시켰다. 리보자임(50 nM)과 기질 RNA (10 nM)< splicing 조건(50 mM HEPES; pH 7.
- 2 pmole M13 forward primer 등을 넣은 후, 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4초의 조건으로 25 cycle의 PCR을 수행하였다. 최종적으로 획득한 PCR 산물에 template suppression reagent를 넣어주고, 변성 과정을 거친 후 염기 서열 분석 기계 (ABI PRISM, Foster City, USA)를 이용하여 그 염기 서열을 결정하였다.
- 형질 전환된 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, MRT을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 탐색하였다. 탐색된 이one DNA에 5X sequencing buffer, terminator ready reaction, 3.2 pmole M13 forward primer 등을 넣은 후, 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4초의 조건으로 25 cycle의 PCR을 수행하였다. 최종적으로 획득한 PCR 산물에 template suppression reagent를 넣어주고, 변성 과정을 거친 후 염기 서열 분석 기계 (ABI PRISM, Foster City, USA)를 이용하여 그 염기 서열을 결정하였다.
- Louis, USA) 항생제가 들어있는 agar plate에서 배양했다. 형질 전환된 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, MRT을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 탐색하였다. 탐색된 이one DNA에 5X sequencing buffer, terminator ready reaction, 3.
대상 데이터
- 또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다. 대조군으로는 wild type Tetrahymena group I intron의 P6 P8 도메인을 갖고 있는 mwsplicing 리보자임(WT)을 이용하였다(Fig. 2B).
- 본 과제에서 제조한 aptazymee 기본적으로 3가지 structural module로 구성되어 있다(Fig. 2A). 첫 번째 modulee theophylline 에 대한 RNA aptamer 부위이다(11).
성능/효과
- RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다. 결론적으로 wild-type 리보자임 (WT), WT의 P6, P8 또는 P6과 P8에 aptamer와 communication module sequence/} 부착된 리보자임(각각 WT-P6H, WT-P8H, WT-P6HP8H) 등 4가지 리보자임을 제작하였다(Fig. 2B). 제작한 aptazyme들의 transsplicing 기능을 검증하기 위하여 리보자임의 3' exon에 firefly luciferase (F.
- 3A). 대조구로서 리보자임 없이 표적 RNA만 반응시에는 어떠한 산물도 형성되지 않았으며 비특이적인 RNA와 각각의 리보자임을 theophylline과 함께 반응 시에도 역시 어떠한 rrans-splicing 산물도 형성되지 않았다(Fig. 3B). 즉 생성된 Zrane-splicing 산물은 리보자임과 표적 RNA 간의 특이적인 반웅에 의한 결과물임을 알 수 있디WT-P6HP8H 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응은 caifeine이 있을 경우엔 아무런 리간드가 없는 경우와 같이 거의 형성되지 않으나 theophylline이 존재할 때에는 caffeine 존재할 때보다 30배 이상 rrae-splicing 반응이 더 잘 일어났다.
- 있다(3, 18). 본 연구를 통하여 Tetrahymena group I intron의 P6 및 P8 도메인 모두에 aptamei를 부착시에 특정 리간드의 aptamer와의 결합에 의해 리보자임 구조를 비활성화 상태에서 활성화 상태로 변이시킬 수 있는 allosteric 리보자임으로 변환될 수 있음을 알았다 이러한 결과는 RNA가 구조적으로 다이내믹한 특성을 함유함으로써 aptamer와 리보자임이라는 두 가지 다른 RNA 저해제들을 융합하여 새로운 구조적 특성 및 새로운 기능을 가진 유전 산물을 개발할 수 있음을 시사한다. 본연 구진은 이전 연구를 통하여 RNA aptamer0!] ligand가 결합 시에 aptam의 구조적 변이를 유발할 수 있음을 알았으며 그러한 결과는 곧 구조적 변이에 의해 그 활성이 조절되는 aptazyme을개발할 수 있는 이론적 근거가 될 수 있다(10).
- 상기 결과로부터 theophylline aptmer가 P6과 P8 domain 모두에 부착된 group I 리보자임은 theophylline 의존적으로 transsplicing 활성이 allosteric하게 유도될 수 있음을 알았다. 과.
- 따라서 group I intron의 P6과 P8 domain 모두에 theophylline aptamei와 communication module 서열을 삽입 했을 때에는 보통 상태에서는 비활성화 상태로 존재하다 theophylline 을 처리한 경우에만 allosteric하게 그리고 효과적으로 transsplicing 반응이 유발되어 기질 RNA를 변형 시킬 수 있었다. 이 결과는 P6과 P8 domain 모두가 alloeiic하게 리보자임 활성을 조절할 수 있는 주요 domain임을 시사한다.
- 3B). 즉 생성된 Zrane-splicing 산물은 리보자임과 표적 RNA 간의 특이적인 반웅에 의한 결과물임을 알 수 있디WT-P6HP8H 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응은 caifeine이 있을 경우엔 아무런 리간드가 없는 경우와 같이 거의 형성되지 않으나 theophylline이 존재할 때에는 caffeine 존재할 때보다 30배 이상 rrae-splicing 반응이 더 잘 일어났다. 더구나 WT-P6HP8H 리보자임에 의한 theophylline 의존성 Zrazis-splicing 반응은 WT 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응과 유사하도록 효과적으로 일어났다(Fig.
후속연구
- 본연 구진은 이전 연구를 통하여 RNA aptamer0!] ligand가 결합 시에 aptam의 구조적 변이를 유발할 수 있음을 알았으며 그러한 결과는 곧 구조적 변이에 의해 그 활성이 조절되는 aptazyme을개발할 수 있는 이론적 근거가 될 수 있다(10). 특히 본 연구를 통하여 발견한 giwp I intim의 allosteric donwn?l P6과 P8 부위에 다른 리간드에 대한 aptamer와 communication module의 삽입, 즉 modular engineering을 통하여 다양한 리간드에 대한 aUosteric mns-splicing 리보자임 개발이 가능할 것으로 예상된다.
- 이러한 리보자임은 HCV RNA 레벨을 감소시킴과 동시에 HCV RNA가 존재하는 곳에서만 치료 유전자 활성을 유도할 수 있으므로 HCV 복제를 보다더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 그러나 보다 더 안전하고 효과적인 유전자 치료제로서 traav-splicing 리보자임이 활용되기 위해선 보다 더 특이적으로 그리고 보다 더 높은 활성을 가지고 HCV 감염된 세포에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 새롭게 개선된 리보자임 시스템이 필요하다.
- 하여도 비가역적으로 리보자임이 표적 RNA를 제거함으로써 항 HCV 기능이 증가되고 동시에 바이러스 감염세포를 제거할 수 있는 항바이러스 유전자 산물의 유도를 꾀할 수 있는 등 보다 특이성과 효능이 개선된 항 HCV 제제 개발이 가능할 것이다. 나아가 trans-splicing aptazyme의 리간드 의존성 활성 유도 성질을 이용, HCV 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 small drug 또는 단백질-단백질 상호반응을 할 수 있는 HCV 조절 인자 결합 단백질 등을 고속 그리고 대량으로 스크리닝할 수 있는 시스템으로도 활용이 가능할 것이다.
- 그러나 각각의 단일 방법만을 이용하여 HCV 복제를 억제하기 위해선 아직 그 특이성 및 안전성과 효능에 한계가 있다. 따라서 보다 특이적이며 효과적으로 HCV 증식을 억제하기 위해선 HCV가 감염된 세포에서만 효과적으로 HCV 복제만을 제어할 수 있는 새로운 유전산물의 개발이 필요하다.
- 기반 리보자임을 개발하였다(21). 이러한 리보자임은 HCV RNA 레벨을 감소시킴과 동시에 HCV RNA가 존재하는 곳에서만 치료 유전자 활성을 유도할 수 있으므로 HCV 복제를 보다더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 그러나 보다 더 안전하고 효과적인 유전자 치료제로서 traav-splicing 리보자임이 활용되기 위해선 보다 더 특이적으로 그리고 보다 더 높은 활성을 가지고 HCV 감염된 세포에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 새롭게 개선된 리보자임 시스템이 필요하다.
- 또한 HCV 조절 인자 의존적으로 리보자임의 활성을 조절함으로써 off-target과 같은 비특이적인리보자임 활성을 억제할 수 있을 것이며 리보자임의 catalytic 기능에 의해서 aptamer가 가역적으로 리간드와 반응한다. 하여도 비가역적으로 리보자임이 표적 RNA를 제거함으로써 항 HCV 기능이 증가되고 동시에 바이러스 감염세포를 제거할 수 있는 항바이러스 유전자 산물의 유도를 꾀할 수 있는 등 보다 특이성과 효능이 개선된 항 HCV 제제 개발이 가능할 것이다. 나아가 trans-splicing aptazyme의 리간드 의존성 활성 유도 성질을 이용, HCV 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 small drug 또는 단백질-단백질 상호반응을 할 수 있는 HCV 조절 인자 결합 단백질 등을 고속 그리고 대량으로 스크리닝할 수 있는 시스템으로도 활용이 가능할 것이다.
- 향 후 HCV 복제의 주요 조절 단백질에 대한 aptamer (10)와 communication module을 allosteric 도메인에 부착하여 HCV 조절 단백질이 존재해야만 trans-splicing 리보자임의 RNA 치환 활성이 allosteric하게 유도될 수 있는 mms-splicing aptazyme을 개발한다면 aptamer에 의해 HCV 조절 단백질을 sequest할 뿐만 아니라 HCV 조절 인자가 발현되어 작동하는 부위로 리보자임의 localization을 집중함으로써 리보자임의 표적 RNA (HCV 유전체) 에 대한 접근성을 증가, 리보자임의 세포 내 활성을 보다 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한 HCV 조절 인자 의존적으로 리보자임의 활성을 조절함으로써 off-target과 같은 비특이적인리보자임 활성을 억제할 수 있을 것이며 리보자임의 catalytic 기능에 의해서 aptamer가 가역적으로 리간드와 반응한다.
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