연구목적 : Methicillin 내성 황색포도알균(methicillin resistant Staphylococcus aurues, MRSA)은 주요 병원성 감염 및 지역사회 획득성 감염균으로 그 발생 빈도가 증가 하고 있다. MRSA의 출현 증가는 vancomycin 사용량을 급격히 증가 시켰고, 이로 인해 vancomycin에 대한 감수성이 저하되는 MRSA들이 1990년대 후반부터 출현하였다. Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA)의 최초 출현 이후 10년이 지났지만 현재까지 vancomycin에 대한 내성 기전은 정확히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 실험실 수준 vancomycin 내성 돌연변이 균주들을 획득하여 돌연변이 균주들에서 발생하는 다양한 세포 표현형의 변화와 병독성 인자의 발현 변화를 조사하여 vancomycin 내성 기전을 분석하였다. 연구 재료 및 방법 : 서울아산병원 임상검체에서 분리 동정된 MRSA와 VISA균주를 step-pressure 방법으로 vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA)를 획득하였다. VRSA의 세포 변형은 ...
연구목적 : Methicillin 내성 황색포도알균(methicillin resistant Staphylococcus aurues, MRSA)은 주요 병원성 감염 및 지역사회 획득성 감염균으로 그 발생 빈도가 증가 하고 있다. MRSA의 출현 증가는 vancomycin 사용량을 급격히 증가 시켰고, 이로 인해 vancomycin에 대한 감수성이 저하되는 MRSA들이 1990년대 후반부터 출현하였다. Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA)의 최초 출현 이후 10년이 지났지만 현재까지 vancomycin에 대한 내성 기전은 정확히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 실험실 수준 vancomycin 내성 돌연변이 균주들을 획득하여 돌연변이 균주들에서 발생하는 다양한 세포 표현형의 변화와 병독성 인자의 발현 변화를 조사하여 vancomycin 내성 기전을 분석하였다. 연구 재료 및 방법 : 서울아산병원 임상검체에서 분리 동정된 MRSA와 VISA균주를 step-pressure 방법으로 vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA)를 획득하였다. VRSA의 세포 변형은 전자현미경으로 관찰하였고, 세포벽 분해 효소들의 활성과 자가분해 효소의 활성을 측정하였다. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)와 agr 유전자형 분석을 통하여 VRSA의 유전적 유사성을 조사하였으며 95종류의 탄소원에 대한 이용 효율성을 측정하여 VRSA에서 나타나는 다양한 표현형을 관찰하였다. VRSA의 병독성 인자들의 발현을 northern blot 및 western blot과 proteomics 기법으로 분석하였고 VRSA의 병원성 변화를 in vivo에서 관찰하였다. 연구 결과 : 실험실 수준 돌연변이 VRSA들 biological fitness는 감소되었고, triton X-100에 의해 촉진되는 자가분해율은 감소하였다. 또한 세포벽 분해 효소인 lysostaphin과 muramidase에 대한 감수성도 감소하였다. 하지만 zymography 분석으로 나타난 peptidoglycan 분해 효소의 활성은 증가되었다. 세포 외부 형태의 불규칙적 변화와 세포벽의 두께가 2배 이상 증가되는 것을 전자현미경을 통해 확인하였다. PFGE와 agr 유전자형 분석을 통해 VRSA의 유전적 유사성을 확인한 결과, 제한효소로 잘려진 chromosomal DNA 단편의 종류가 매우 유사하게 나타났고, vancomycin 내성을 획득한 균주는 모두 agr group II에 속하였다. Carboxylate 와 carbohydrate를 생합성하는 탄소원의 대사 효율은 VRSA에서 전반적으로 낮았지만, 세균의 기초 대사 작용에 반드시 필요한 핵산 합성, 아미노산 합성에 관련된 탄소원에 대해서는 모균과 동일한 대사 효율성을 나타냈다. VRSA에서 병독성 인자 조절 유전자들인 agr과 sigB의 발현은 감소하였지만, sarA의 발현은 증가하였다. 이들 조절 유전자에 의존적인 병독성 유전자들인 spa, tst, atl 유전자의 발현은 감소하였지만 fnbA의 발현은 변하지 않았다. 분비되는 세포외 단백질 중 alpha-hemolysin, beta-hemolysin, exoprotein 15, autolysin precursor, surface protein, serine protease들은 VRSA에서 발현이 억제되었다. 모균인 MRSA와 VISA균주에 감염된 군집의 생존율은 0%이지만 VRSA에 감염된 마우스 군집의 생존율은 100%이였다. 결론 ：본 연구에 사용된 MRSA 균주와 VISA 균주들은 유전적으로 매우 유사한 성상을 나타냈다. VRSA 세포 표현형의 변화 중 세포벽 두께의 증가는 세포벽 합성율이 분해율 보다 높기 때문이며, fatty acid의 합성에 필요한 탄소원인 tween 40과 tween 80의 이용 효율성이 증가했기 때문에 세포벽 합성이 증가하여 세포벽 두께가 두꺼워졌다. 또한 VRSA에서 agr 유전자의 발현 감소는 자가분해 효소 유전자인 atl의 발현을 감소시켜 자가분해율을 감소시키지만 sarA 유전자의 발현 증가로 sarA 의존적인 peptidoglycan 분해 효소들의 활성은 증가한다. 또한 sigB의 발현 감소로 인해 chaperon DnaK 단백질의 발현이 억제되었다. 이런 병독성 인자 조절 유전자들의 발현 억제로 인해 VRSA의 병원성은 감소하였다. 따라서 vancomycin 내성 기전은 다른 항균제의 내성 기전처럼 세포의 특정 유전자의 발현에 의한 것이 아니고 세포벽 합성과 분해에 관련된 유전자들과 병독성 인자 조절 유전자들의 상호 작용에 관련이 있다. 중심단어: Staphylococcus aureus, Methicillin, Vancomycin, Biological fitness, Virulence factor, Sepsismodel
연구목적 : Methicillin 내성 황색포도알균(methicillin resistant Staphylococcus aurues, MRSA)은 주요 병원성 감염 및 지역사회 획득성 감염균으로 그 발생 빈도가 증가 하고 있다. MRSA의 출현 증가는 vancomycin 사용량을 급격히 증가 시켰고, 이로 인해 vancomycin에 대한 감수성이 저하되는 MRSA들이 1990년대 후반부터 출현하였다. Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA)의 최초 출현 이후 10년이 지났지만 현재까지 vancomycin에 대한 내성 기전은 정확히 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 실험실 수준 vancomycin 내성 돌연변이 균주들을 획득하여 돌연변이 균주들에서 발생하는 다양한 세포 표현형의 변화와 병독성 인자의 발현 변화를 조사하여 vancomycin 내성 기전을 분석하였다. 연구 재료 및 방법 : 서울아산병원 임상검체에서 분리 동정된 MRSA와 VISA균주를 step-pressure 방법으로 vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA)를 획득하였다. VRSA의 세포 변형은 전자현미경으로 관찰하였고, 세포벽 분해 효소들의 활성과 자가분해 효소의 활성을 측정하였다. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)와 agr 유전자형 분석을 통하여 VRSA의 유전적 유사성을 조사하였으며 95종류의 탄소원에 대한 이용 효율성을 측정하여 VRSA에서 나타나는 다양한 표현형을 관찰하였다. VRSA의 병독성 인자들의 발현을 northern blot 및 western blot과 proteomics 기법으로 분석하였고 VRSA의 병원성 변화를 in vivo에서 관찰하였다. 연구 결과 : 실험실 수준 돌연변이 VRSA들 biological fitness는 감소되었고, triton X-100에 의해 촉진되는 자가분해율은 감소하였다. 또한 세포벽 분해 효소인 lysostaphin과 muramidase에 대한 감수성도 감소하였다. 하지만 zymography 분석으로 나타난 peptidoglycan 분해 효소의 활성은 증가되었다. 세포 외부 형태의 불규칙적 변화와 세포벽의 두께가 2배 이상 증가되는 것을 전자현미경을 통해 확인하였다. PFGE와 agr 유전자형 분석을 통해 VRSA의 유전적 유사성을 확인한 결과, 제한효소로 잘려진 chromosomal DNA 단편의 종류가 매우 유사하게 나타났고, vancomycin 내성을 획득한 균주는 모두 agr group II에 속하였다. Carboxylate 와 carbohydrate를 생합성하는 탄소원의 대사 효율은 VRSA에서 전반적으로 낮았지만, 세균의 기초 대사 작용에 반드시 필요한 핵산 합성, 아미노산 합성에 관련된 탄소원에 대해서는 모균과 동일한 대사 효율성을 나타냈다. VRSA에서 병독성 인자 조절 유전자들인 agr과 sigB의 발현은 감소하였지만, sarA의 발현은 증가하였다. 이들 조절 유전자에 의존적인 병독성 유전자들인 spa, tst, atl 유전자의 발현은 감소하였지만 fnbA의 발현은 변하지 않았다. 분비되는 세포외 단백질 중 alpha-hemolysin, beta-hemolysin, exoprotein 15, autolysin precursor, surface protein, serine protease들은 VRSA에서 발현이 억제되었다. 모균인 MRSA와 VISA균주에 감염된 군집의 생존율은 0%이지만 VRSA에 감염된 마우스 군집의 생존율은 100%이였다. 결론 ：본 연구에 사용된 MRSA 균주와 VISA 균주들은 유전적으로 매우 유사한 성상을 나타냈다. VRSA 세포 표현형의 변화 중 세포벽 두께의 증가는 세포벽 합성율이 분해율 보다 높기 때문이며, fatty acid의 합성에 필요한 탄소원인 tween 40과 tween 80의 이용 효율성이 증가했기 때문에 세포벽 합성이 증가하여 세포벽 두께가 두꺼워졌다. 또한 VRSA에서 agr 유전자의 발현 감소는 자가분해 효소 유전자인 atl의 발현을 감소시켜 자가분해율을 감소시키지만 sarA 유전자의 발현 증가로 sarA 의존적인 peptidoglycan 분해 효소들의 활성은 증가한다. 또한 sigB의 발현 감소로 인해 chaperon DnaK 단백질의 발현이 억제되었다. 이런 병독성 인자 조절 유전자들의 발현 억제로 인해 VRSA의 병원성은 감소하였다. 따라서 vancomycin 내성 기전은 다른 항균제의 내성 기전처럼 세포의 특정 유전자의 발현에 의한 것이 아니고 세포벽 합성과 분해에 관련된 유전자들과 병독성 인자 조절 유전자들의 상호 작용에 관련이 있다. 중심단어: Staphylococcus aureus, Methicillin, Vancomycin, Biological fitness, Virulence factor, Sepsis model
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