[학위논문]제 4형 콜라겐 부착시험과 genome-scale analysis를 이용한 상피줄기세포의 새로운 표지자 연구 Identification of new markers for human keratinocyte stem cells using adhesiveness to collagen type IV and genome-scale analysis원문보기
사람의 표피나 점막의 줄기세포는 일생동한 증식능을 유지하며 자가재생을 담당하고 무수한 자손세포를 만드는 성질을 가지므로 상피의 재생이나 유전자 치료에 이용할 수 있고 상피세포로 이루어진 암형성의 발생기전에 대한 연구에 결정적인 단서를 제공한다. 이러한 줄기세포를 임상적으로 적용하려면 사람의 표피나 점막의 줄기세포를 인지하고 분리하는 것이 가장 중요한 기초 단계이다. 그러나 상피 줄기세포에 대한 표지자를 찾고자 하는 연구가 과거 5년 이상 계속되었고 몇 가지 후보 표지자가 제시 되었으나 특이적인 표지자는 아직 확실히 밝혀지지 않았다. 과거 결과를 보면 6, 4 integrin, cytokeratin 5/14, 19의 발현 양상, colony forming assay를 이용한 clonal analysis로 holoclones 세포집락 동정 등의 접근이 이루어졌지만 순수한 줄기세포의 분리가 어렵고 또 분리하더라도 이렇게 해서 얻어진 세포들이 줄기세포의 진정한 성질을 유지하는지에 대한 확인이 결여되어 있었다. 이에 연구자는 ...
사람의 표피나 점막의 줄기세포는 일생동한 증식능을 유지하며 자가재생을 담당하고 무수한 자손세포를 만드는 성질을 가지므로 상피의 재생이나 유전자 치료에 이용할 수 있고 상피세포로 이루어진 암형성의 발생기전에 대한 연구에 결정적인 단서를 제공한다. 이러한 줄기세포를 임상적으로 적용하려면 사람의 표피나 점막의 줄기세포를 인지하고 분리하는 것이 가장 중요한 기초 단계이다. 그러나 상피 줄기세포에 대한 표지자를 찾고자 하는 연구가 과거 5년 이상 계속되었고 몇 가지 후보 표지자가 제시 되었으나 특이적인 표지자는 아직 확실히 밝혀지지 않았다. 과거 결과를 보면 6, 4 integrin, cytokeratin 5/14, 19의 발현 양상, colony forming assay를 이용한 clonal analysis로 holoclones 세포집락 동정 등의 접근이 이루어졌지만 순수한 줄기세포의 분리가 어렵고 또 분리하더라도 이렇게 해서 얻어진 세포들이 줄기세포의 진정한 성질을 유지하는지에 대한 확인이 결여되어 있었다. 이에 연구자는 각질형성세포 내 줄기세포의 가장 중요한 특징인 유해환경에 저항하고 일생 동안 재생되는 성질과 기저막의 collagen type IV에 부착을 매우 잘하는 성질을 이용하여 줄기세포를 분리하고자 하였다. 사람 편도 각질형성세포를 이용하여 collagen type IV 부착능 검사를 시행 후 분획으로 나누어 ACP-based PCR과 western blotting 검사를 시행하였다. ACP-based PCR 결과 상, 부착능 검사에서 차이를 보였던 두 분획 사이에 C1 (mitochondrion), C2 (mitochondrion), C5 (mitochondrion), C8 (mitochondrial DNA), 그리고 C7 (S100 calcium binding protein A8) 에서 유의한 양적인 차이를 보였고, western blotting 상에서 급속한 부착능을 보인 세포(rapidly adhering cells) 에서 비 부착 세포 (non-adhering cells) 보다 mitochondrial complex I, Cytochrome coxidase (COX) I, COX IV, 그리고 Peroxiredoxin (Prx) IV 에서 모두 일관된 감소가 관찰 되었다. 자외선 조사를 통해 표피에 손상을 가해도 줄기세포는 저항할 것이라는 가정 하에 배양된 각질형성세포 표본에 자외선 B를 각각 0, 25, 50, 100 mJ/cm2 조사하였고, 6 integrin 과 p63 항체를 이용한 flow cytometry 분석을 시행하였다. 결과적으로, UVB 조사 0 mJ/cm2 에서 6+p63+ 세포는 12.98% 를 나타냈고, 100mJ/cm2 에서는 92.80% 로 높게 나타났다. 이러한 결과를 토대로 볼 때 감소된 mitochondria의 내용물은 각질형성세포 내 줄기세포의 한 특징임을 알 수 있었고, 아마도 자외선 조사와 같은 유해 환경에 저항하는 줄기세포의 특징과 관련된 소견이 아닐까 생각할 수 있었다. 이번 연구 결과를 통해 추후 유전 생화학적 차이점을 이용한 줄기세포 연구에 큰 도움을 줄 것으로 기대한다. Key Words: 줄기세포, 일과성 증폭 세포, 부착능 검사, integrin, p63, 미토콘드리아
사람의 표피나 점막의 줄기세포는 일생동한 증식능을 유지하며 자가재생을 담당하고 무수한 자손세포를 만드는 성질을 가지므로 상피의 재생이나 유전자 치료에 이용할 수 있고 상피세포로 이루어진 암형성의 발생기전에 대한 연구에 결정적인 단서를 제공한다. 이러한 줄기세포를 임상적으로 적용하려면 사람의 표피나 점막의 줄기세포를 인지하고 분리하는 것이 가장 중요한 기초 단계이다. 그러나 상피 줄기세포에 대한 표지자를 찾고자 하는 연구가 과거 5년 이상 계속되었고 몇 가지 후보 표지자가 제시 되었으나 특이적인 표지자는 아직 확실히 밝혀지지 않았다. 과거 결과를 보면 6, 4 integrin, cytokeratin 5/14, 19의 발현 양상, colony forming assay를 이용한 clonal analysis로 holoclones 세포집락 동정 등의 접근이 이루어졌지만 순수한 줄기세포의 분리가 어렵고 또 분리하더라도 이렇게 해서 얻어진 세포들이 줄기세포의 진정한 성질을 유지하는지에 대한 확인이 결여되어 있었다. 이에 연구자는 각질형성세포 내 줄기세포의 가장 중요한 특징인 유해환경에 저항하고 일생 동안 재생되는 성질과 기저막의 collagen type IV에 부착을 매우 잘하는 성질을 이용하여 줄기세포를 분리하고자 하였다. 사람 편도 각질형성세포를 이용하여 collagen type IV 부착능 검사를 시행 후 분획으로 나누어 ACP-based PCR과 western blotting 검사를 시행하였다. ACP-based PCR 결과 상, 부착능 검사에서 차이를 보였던 두 분획 사이에 C1 (mitochondrion), C2 (mitochondrion), C5 (mitochondrion), C8 (mitochondrial DNA), 그리고 C7 (S100 calcium binding protein A8) 에서 유의한 양적인 차이를 보였고, western blotting 상에서 급속한 부착능을 보인 세포(rapidly adhering cells) 에서 비 부착 세포 (non-adhering cells) 보다 mitochondrial complex I, Cytochrome c oxidase (COX) I, COX IV, 그리고 Peroxiredoxin (Prx) IV 에서 모두 일관된 감소가 관찰 되었다. 자외선 조사를 통해 표피에 손상을 가해도 줄기세포는 저항할 것이라는 가정 하에 배양된 각질형성세포 표본에 자외선 B를 각각 0, 25, 50, 100 mJ/cm2 조사하였고, 6 integrin 과 p63 항체를 이용한 flow cytometry 분석을 시행하였다. 결과적으로, UVB 조사 0 mJ/cm2 에서 6+p63+ 세포는 12.98% 를 나타냈고, 100mJ/cm2 에서는 92.80% 로 높게 나타났다. 이러한 결과를 토대로 볼 때 감소된 mitochondria의 내용물은 각질형성세포 내 줄기세포의 한 특징임을 알 수 있었고, 아마도 자외선 조사와 같은 유해 환경에 저항하는 줄기세포의 특징과 관련된 소견이 아닐까 생각할 수 있었다. 이번 연구 결과를 통해 추후 유전 생화학적 차이점을 이용한 줄기세포 연구에 큰 도움을 줄 것으로 기대한다. Key Words: 줄기세포, 일과성 증폭 세포, 부착능 검사, integrin, p63, 미토콘드리아
The renewal of human epidermis is governed by keratinocyte stem cells (KSC). Identification of KSC markers is important for the clinical application of epithelial cell therapy as well as for studies on epithelial tumorigenesis. However, neither highly specific KSC markers have yet been identified no...
The renewal of human epidermis is governed by keratinocyte stem cells (KSC). Identification of KSC markers is important for the clinical application of epithelial cell therapy as well as for studies on epithelial tumorigenesis. However, neither highly specific KSC markers have yet been identified nor pure KSC cultures are available. In this study, we isolated KSC and transient amplifying cells (TAC) populations from human tonsilar keratinocytes utilizing the adhering capability of KSC to collagen IV-coated plate and further screened for the differentially expressed markers of KSC by genome-scale analysis of differentially expressed genes. ACP-based differentially displayed PCR revealed that levels of mitochondria-related gene expression were low in KSC compared to TAC. Western blot analysis confirmed that mitochondrial complex I, complex IV and peroxiredoxin IV expression were lower in KSC than in TAC. Mitochondrial membrane potential was lower in KSC. In addition, we irradiated primary normal skin keratinocytes with ultraviolet B (UVB) for 14 days and analyzed by flow cytometry after labeling with antibodies against ??6 integrin and p63. UVB irradiation (100 mJ/cm2) enriched the ??6+/p63+ double positive cells from 12.98% to 92.80%. Since tissue regenerating ability of stem cells after injury may be the most important in distinguishing KSC from TAC, it was noted that UVB irradiation might damage epidermis but not KSC which should be resistant to injury for self-maintenance. Taken together, results of this study suggest that reduced mitochondrial contents and function in rapidly adhering KSC would be one of important criteria to define KSC in addition to resistance to noxious injury and adhesiveness to collagen IV. Key Words: keratinocyte stem cell, transient amplifying cell, adhesion assay, integrin, p63, mitochondria
The renewal of human epidermis is governed by keratinocyte stem cells (KSC). Identification of KSC markers is important for the clinical application of epithelial cell therapy as well as for studies on epithelial tumorigenesis. However, neither highly specific KSC markers have yet been identified nor pure KSC cultures are available. In this study, we isolated KSC and transient amplifying cells (TAC) populations from human tonsilar keratinocytes utilizing the adhering capability of KSC to collagen IV-coated plate and further screened for the differentially expressed markers of KSC by genome-scale analysis of differentially expressed genes. ACP-based differentially displayed PCR revealed that levels of mitochondria-related gene expression were low in KSC compared to TAC. Western blot analysis confirmed that mitochondrial complex I, complex IV and peroxiredoxin IV expression were lower in KSC than in TAC. Mitochondrial membrane potential was lower in KSC. In addition, we irradiated primary normal skin keratinocytes with ultraviolet B (UVB) for 14 days and analyzed by flow cytometry after labeling with antibodies against ??6 integrin and p63. UVB irradiation (100 mJ/cm2) enriched the ??6+/p63+ double positive cells from 12.98% to 92.80%. Since tissue regenerating ability of stem cells after injury may be the most important in distinguishing KSC from TAC, it was noted that UVB irradiation might damage epidermis but not KSC which should be resistant to injury for self-maintenance. Taken together, results of this study suggest that reduced mitochondrial contents and function in rapidly adhering KSC would be one of important criteria to define KSC in addition to resistance to noxious injury and adhesiveness to collagen IV. Key Words: keratinocyte stem cell, transient amplifying cell, adhesion assay, integrin, p63, mitochondria
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