배뇨반사를 조절하는 주골반 신경절은 중추신경계의 명령을 효과기에 전달하는 릴레이 스테이션 역할도 하지만 국부적으로 발생하는 다양한 정보를 가지고 통합하는 지역통합센터의 역할을 담당하고 있다. 주골반신경절은 같은 신경절 캡슐 내에 교감 및 부교감 신경세포를 가지고 있는 다른 자율신경절과는 구별돠는 특징을 가지고 있다. 이러한 주골반 신경절은 그 해부학적 구조가 단순하여 분리 및 정량화가 용이하기 때문에 골반장기의 신경조절의 생리 및 병태생리학적 메커니즘을 규명하는 연구의 모델 시스템으로 많이 사용되고 있다.성숙된 신경에서 GABA는 억제성 ...
배뇨반사를 조절하는 주골반 신경절은 중추신경계의 명령을 효과기에 전달하는 릴레이 스테이션 역할도 하지만 국부적으로 발생하는 다양한 정보를 가지고 통합하는 지역통합센터의 역할을 담당하고 있다. 주골반신경절은 같은 신경절 캡슐 내에 교감 및 부교감 신경세포를 가지고 있는 다른 자율신경절과는 구별돠는 특징을 가지고 있다. 이러한 주골반 신경절은 그 해부학적 구조가 단순하여 분리 및 정량화가 용이하기 때문에 골반장기의 신경조절의 생리 및 병태생리학적 메커니즘을 규명하는 연구의 모델 시스템으로 많이 사용되고 있다.성숙된 신경에서 GABA는 억제성 신경전달물질로 알려져 있지만 주골반 신경 절에서 가바는 세포막의 탈분극을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구의 목적은 지금까지 규명되지 않은 주골반신경절에서 흥분성 가바작용이 나타나는 메커니즘을 분자 수준에서 최초로 규명하고자 하였다. 이를 위하여 그라미시딘 천공 패치클램프 방법, 역전사 연쇄 중합반응, 세포핵 내 미세 주입에 의한 유전자의 도입, 면역조직화학 등의 연구방법을 사용하였다.가바 전류는 세포의 전기용량이 크며 티-형 칼슘채널을 발현하는 주골반 교감신경세포에서 주로 기록되었는데 비큐쿨린과 피크로톡신에 의해 억제되었기 때문에 가바 에이 수용체 활성을 통해 나타났음을 알 수 있었다. 또한 세포외 액의 염소이온 농도를 변화시켰을 때 가바전류의 역전전압이 이에 비례하여 변하는 것을 관찰하여 가바전류가 염소이온의 이동에 의한 것임을 확인하였다. 면역조직화학 염색으로 주골반신경절 내에 가바가 생리적으로 존재하는 것과 가바 에이 수용체가 타이로신 수산화효소에 양성인 교감신경세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 주골반 교감 신경세포에서 가바에 의한 탈분극이 일어났으며 그 크기는 시간 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 주골반 부교감 신경세포에서는 가바에 의한 막전압의 변동이 나타나지 않았다. 분리한 후 3~4시간 경과 후 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바전류의 역전전압은 약 -43 밀리볼트로 안정막 전압보다 낮다는 것을 확인하였고, 넌스트 공식을 사용하여 세포 내 생리적인 염소이온의 농도는 약 30 밀리몰인 것으로 추정하였다. 가바의 역전전압과 세포 내 염소이온의 농도는 세포를 24시간 배양 한 후 감소하는 경향을 보였다. 역전사 연쇄중합반응 분석 결과 주골반 신경절은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1과 포타슘-염소이온 공수송체 1을 발현하나 신경특이적으로 분포하여 세포 내 염소이온의 농도를 낮게 세팅하는 역할을 하는 포타슘-염소이온 공수송체 2는 발현하지 않는 것을 확인하였다. 포타슘-염소이온 공수송체 2를 주골반 교감 신경세포에 과발현 시켰을 때 녹색형광 단백질만 과발현하는 대조군에 비해 가바의 역전전압이 음성으로 약 30 밀리볼트 정도 이동하였으며 세포 내 생리적인 염소이온의 농도가 22 밀리몰에서 6.5 밀리몰로 감소하였음을 알 수 있었다. 포타슘-염소이온 공수송체 2가 과발현된 주골반 교감 신경세포에 가바를 가하였을 때 탈분극이 아닌 과분극이 유발되었으며 이러한 가바의 억제성 작용은 포타슘-염소이온 공수송체 2 차단제인 퓨로세마이드의 전 처치에 의해 소실되었다. 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바 전류의 역전전압은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1을 차단하는 부메타나이드에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 세포외액에 중탄산염을 포함시켰을 때도 변동되지 않았다.이상의 결과들을 토대로 성숙 쥐의 주골반 신경세포에서 가바의 흥분성 작용이 세포 내 염소이온의 농도를 낮추는 포타슘-염소이온 공수송체 2의 발현 부재에 의해서 기인한다는 결론을 얻었다.
배뇨반사를 조절하는 주골반 신경절은 중추신경계의 명령을 효과기에 전달하는 릴레이 스테이션 역할도 하지만 국부적으로 발생하는 다양한 정보를 가지고 통합하는 지역통합센터의 역할을 담당하고 있다. 주골반신경절은 같은 신경절 캡슐 내에 교감 및 부교감 신경세포를 가지고 있는 다른 자율신경절과는 구별돠는 특징을 가지고 있다. 이러한 주골반 신경절은 그 해부학적 구조가 단순하여 분리 및 정량화가 용이하기 때문에 골반장기의 신경조절의 생리 및 병태생리학적 메커니즘을 규명하는 연구의 모델 시스템으로 많이 사용되고 있다.성숙된 신경에서 GABA는 억제성 신경전달물질로 알려져 있지만 주골반 신경 절에서 가바는 세포막의 탈분극을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구의 목적은 지금까지 규명되지 않은 주골반신경절에서 흥분성 가바작용이 나타나는 메커니즘을 분자 수준에서 최초로 규명하고자 하였다. 이를 위하여 그라미시딘 천공 패치클램프 방법, 역전사 연쇄 중합반응, 세포핵 내 미세 주입에 의한 유전자의 도입, 면역조직화학 등의 연구방법을 사용하였다.가바 전류는 세포의 전기용량이 크며 티-형 칼슘채널을 발현하는 주골반 교감신경세포에서 주로 기록되었는데 비큐쿨린과 피크로톡신에 의해 억제되었기 때문에 가바 에이 수용체 활성을 통해 나타났음을 알 수 있었다. 또한 세포외 액의 염소이온 농도를 변화시켰을 때 가바전류의 역전전압이 이에 비례하여 변하는 것을 관찰하여 가바전류가 염소이온의 이동에 의한 것임을 확인하였다. 면역조직화학 염색으로 주골반신경절 내에 가바가 생리적으로 존재하는 것과 가바 에이 수용체가 타이로신 수산화효소에 양성인 교감신경세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 주골반 교감 신경세포에서 가바에 의한 탈분극이 일어났으며 그 크기는 시간 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 주골반 부교감 신경세포에서는 가바에 의한 막전압의 변동이 나타나지 않았다. 분리한 후 3~4시간 경과 후 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바전류의 역전전압은 약 -43 밀리볼트로 안정막 전압보다 낮다는 것을 확인하였고, 넌스트 공식을 사용하여 세포 내 생리적인 염소이온의 농도는 약 30 밀리몰인 것으로 추정하였다. 가바의 역전전압과 세포 내 염소이온의 농도는 세포를 24시간 배양 한 후 감소하는 경향을 보였다. 역전사 연쇄중합반응 분석 결과 주골반 신경절은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1과 포타슘-염소이온 공수송체 1을 발현하나 신경특이적으로 분포하여 세포 내 염소이온의 농도를 낮게 세팅하는 역할을 하는 포타슘-염소이온 공수송체 2는 발현하지 않는 것을 확인하였다. 포타슘-염소이온 공수송체 2를 주골반 교감 신경세포에 과발현 시켰을 때 녹색형광 단백질만 과발현하는 대조군에 비해 가바의 역전전압이 음성으로 약 30 밀리볼트 정도 이동하였으며 세포 내 생리적인 염소이온의 농도가 22 밀리몰에서 6.5 밀리몰로 감소하였음을 알 수 있었다. 포타슘-염소이온 공수송체 2가 과발현된 주골반 교감 신경세포에 가바를 가하였을 때 탈분극이 아닌 과분극이 유발되었으며 이러한 가바의 억제성 작용은 포타슘-염소이온 공수송체 2 차단제인 퓨로세마이드의 전 처치에 의해 소실되었다. 주골반 교감 신경세포에서 기록된 가바 전류의 역전전압은 소듐-포타슘-염소이온 공수송체 1을 차단하는 부메타나이드에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 세포외액에 중탄산염을 포함시켰을 때도 변동되지 않았다.이상의 결과들을 토대로 성숙 쥐의 주골반 신경세포에서 가바의 흥분성 작용이 세포 내 염소이온의 농도를 낮추는 포타슘-염소이온 공수송체 2의 발현 부재에 의해서 기인한다는 결론을 얻었다.
Major pelvic ganglia (MPG) controlling micturition play roles of not only a station relaying commands from the central nervous system (CNS) to effectors but also a center integrating various local infromation. A distinctive feature of the pelvic ganglia that differentiate them from other autonomic g...
Major pelvic ganglia (MPG) controlling micturition play roles of not only a station relaying commands from the central nervous system (CNS) to effectors but also a center integrating various local infromation. A distinctive feature of the pelvic ganglia that differentiate them from other autonomic ganglia is the colocalization of both sympathetic and parasympathetic neurons within the same ganglion capsule. Because of their relative simple anatomy and thus, ease of isolation and quantification, MPG has been used as a model system for studying physiological and pathophysiological mechanisms underlying neural control of pelvic organs such as the urinary bladder.In mature neurons of the CNS, GABA is a inhibitory neurotransmitter. However, GABA depolarized membranes of the MPG neurons from adult rat. Accordingly, the purpose of the present study was to examine for the first time molecular mechanism underlying excitatory GABA action in the MPG of adult rat. In this regard, various experimental techniques including gramicidin- perforated patch-clamp, RT-PCR, intranuclear microinjection of genes, and immunohistochemistry were employed.GABA currents were recorded mostly in the sympathetic MPG neurons with large capacitance and T-type Ca2+ channels and were found to be conducted through bicuculin- and picrotoxin-sensitive GABAA receptors. In addition, reversal potentials of the GABA currents (EGABA) varied in proportion to external Cl- concentration, indicating that Cl- is primarily permeable to the GABAA receptors. Immunohistochemistry revealed presence of GABA and preferential expression of GABAA receptors in TH-positive sympathetic neurons. In the sympathetic MPG neurons, application of GABA produced depolarization of which amplitude was time-dependently decreased. Conversely, the GABA action was not observed in the parasympathetic MPG neurons. Three to four hours after dissociation, EGABA was about -43 mV which was lower than resting membrane potentials. As estimated using the Nernst equation, the concentration of intracellular Cl- ion([Cl]in) was estimated at about 30 mM. The [Cl]in tended to be decreased after 24 hour culture. RT-PCR analysis showed that MPG express NKCC1 and KCC1 but not KCC2 which is critical for setting [Cl]in low. When KCC2 was overexpressed in the sympathetic MPG neurons, EGABA was negatively shifted about 30 mV and physiological [Cl]in was reduced from 22 mM to 6.5 mM. Furthermore, GABA produced hyperpolarization, which was prevented by furosemide, a KCC2 blocker in the sympathetic MPG neurons overexpressing KCC2. In addition, EGABA was not altered by external HCO3- and bumetanide, a NKCC1 blocker.Taken together, it was concluded that the excitatory GABA action arises from lack of KCC2 exprresson which is capable of lowering [Cl]in in the sympathetic MPG neurons of adult rats.
Major pelvic ganglia (MPG) controlling micturition play roles of not only a station relaying commands from the central nervous system (CNS) to effectors but also a center integrating various local infromation. A distinctive feature of the pelvic ganglia that differentiate them from other autonomic ganglia is the colocalization of both sympathetic and parasympathetic neurons within the same ganglion capsule. Because of their relative simple anatomy and thus, ease of isolation and quantification, MPG has been used as a model system for studying physiological and pathophysiological mechanisms underlying neural control of pelvic organs such as the urinary bladder.In mature neurons of the CNS, GABA is a inhibitory neurotransmitter. However, GABA depolarized membranes of the MPG neurons from adult rat. Accordingly, the purpose of the present study was to examine for the first time molecular mechanism underlying excitatory GABA action in the MPG of adult rat. In this regard, various experimental techniques including gramicidin- perforated patch-clamp, RT-PCR, intranuclear microinjection of genes, and immunohistochemistry were employed.GABA currents were recorded mostly in the sympathetic MPG neurons with large capacitance and T-type Ca2+ channels and were found to be conducted through bicuculin- and picrotoxin-sensitive GABAA receptors. In addition, reversal potentials of the GABA currents (EGABA) varied in proportion to external Cl- concentration, indicating that Cl- is primarily permeable to the GABAA receptors. Immunohistochemistry revealed presence of GABA and preferential expression of GABAA receptors in TH-positive sympathetic neurons. In the sympathetic MPG neurons, application of GABA produced depolarization of which amplitude was time-dependently decreased. Conversely, the GABA action was not observed in the parasympathetic MPG neurons. Three to four hours after dissociation, EGABA was about -43 mV which was lower than resting membrane potentials. As estimated using the Nernst equation, the concentration of intracellular Cl- ion([Cl]in) was estimated at about 30 mM. The [Cl]in tended to be decreased after 24 hour culture. RT-PCR analysis showed that MPG express NKCC1 and KCC1 but not KCC2 which is critical for setting [Cl]in low. When KCC2 was overexpressed in the sympathetic MPG neurons, EGABA was negatively shifted about 30 mV and physiological [Cl]in was reduced from 22 mM to 6.5 mM. Furthermore, GABA produced hyperpolarization, which was prevented by furosemide, a KCC2 blocker in the sympathetic MPG neurons overexpressing KCC2. In addition, EGABA was not altered by external HCO3- and bumetanide, a NKCC1 blocker.Taken together, it was concluded that the excitatory GABA action arises from lack of KCC2 exprresson which is capable of lowering [Cl]in in the sympathetic MPG neurons of adult rats.
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