PKA activity를 낮추기 위한 정제조건으로 개선된 Cohn 6 Method를 변형하여 분획 Ⅳ공정을 Ⅳ-1과 Ⅳ-4로 분리실시하고 반응 중에 정치공정을 두어 불순 단백질이 침전될 수 있는 충분한 반응시간을 주어 진행하였다.(분획방법 2) 결과적으로 기존방법인 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 반응완료액을 여과하여 Ⅳ-1, Ⅳ-4 구분 없이 바로 pH 5.9, 에탄올 농도 40%, 온도 -10℃로 Fraction Ⅳ공정을 진행한 경우(분획방법 1) PKA activity수치가 평균 19.2 IU/mL이었고, 분획방법 2로 진행한 검체는 평균 8.5 IU/mL로서 제제기준인 35 IU/mL와 비교 했을 때 24.3% 수준의 낮은 결과를 보였다. 에탄올과 염 및 기타 불순 단백질을 제거하기 위해 실시하는 ...
PKA activity를 낮추기 위한 정제조건으로 개선된 Cohn 6 Method를 변형하여 분획 Ⅳ공정을 Ⅳ-1과 Ⅳ-4로 분리실시하고 반응 중에 정치공정을 두어 불순 단백질이 침전될 수 있는 충분한 반응시간을 주어 진행하였다.(분획방법 2) 결과적으로 기존방법인 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 반응완료액을 여과하여 Ⅳ-1, Ⅳ-4 구분 없이 바로 pH 5.9, 에탄올 농도 40%, 온도 -10℃로 Fraction Ⅳ공정을 진행한 경우(분획방법 1) PKA activity수치가 평균 19.2 IU/mL이었고, 분획방법 2로 진행한 검체는 평균 8.5 IU/mL로서 제제기준인 35 IU/mL와 비교 했을 때 24.3% 수준의 낮은 결과를 보였다. 에탄올과 염 및 기타 불순 단백질을 제거하기 위해 실시하는 한외여과 공정에서 사용되는 투석용액을 1.1% NaCl용액과 주사용수로 하여 첫 번째 조건으로 각각 투석 교체용량의 5.5배, 1.5배 사용한 경우 알루미늄 금속이온 제거율이 94%였으며, 두 번째, 1.1% NaCl용액과 주사용수를 각각 투석 교체용량의 3배, 4배 사용한 경우는 97.7%가 제거되었다. 세 번째, 주사용수만 투석 교체용량의 7배 투입한 경우는 상대적으로 낮은 81.4%를 나타냈다. 결과를 볼 때 세 조건 모두 유럽약전 기준인 200 ppb 이하의 값을 보였으나 교체 투석액으로 NaCl용액을 3배 이상 사용하는 것이 많은 양의 알루미늄 이온을 제거시키는데 효과가 있었다. 분획 Ⅴ(알부민 침전물)를 대상으로 COHN 분획 VR 반응조건을 달리해 정제방법 2 조건대로 단백질 농도 3%, 에탄올 농도 12%, 이온강도 0.01, 온도 -3℃ 에서 공정을 진행한 결과 반응용액의 여과 전후 탁도 변화가 127 NTU에서 8.6 NTU로 90%이상 낮아져 여과를 통해 상당한 양의 이물질들이 제거되었고 그와 더불어 바이러스 불활화를 위한 열처리공정 전, 후의 반응용액 내 중합물(trimer)값을 비교해 보아도 각각 0.7%, 5.43%로 정제방법 1의 1.09%, 7.3%보다 낮았고, Heme 함량도 5.43으로 정제방법 1의 7.3보다 낮아 정제도 면에서 좋은 결과를 보였다. 알부민 용액에 함유된 발열성 유발물질인 endotoxin을 제거하기 위해 처리되는 알부민 용액의 농도를 10%와 20%로 나누고 각각에 대해 이온강도를 0, 0.07, 0.14로 맞춘 뒤 약 음이온교환수지인 DEAE Sephadex A50 Resin을 0.5%와 0.1%씩 처리하였다. 정제 결과 알부민 농도에 상관없이 resin을 최종농도 기준으로 0.5%로 처리했을 시 음이온을 띠는 endotoxin입자가 더 많이 흡착 분리되어 95%정도의 제거 효과를 보였고, resin 처리비율이 0.1%로 낮은 경우 이온강도가 낮을수록 endotoxin 제거율이 높았다.
PKA activity를 낮추기 위한 정제조건으로 개선된 Cohn 6 Method를 변형하여 분획 Ⅳ공정을 Ⅳ-1과 Ⅳ-4로 분리실시하고 반응 중에 정치공정을 두어 불순 단백질이 침전될 수 있는 충분한 반응시간을 주어 진행하였다.(분획방법 2) 결과적으로 기존방법인 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 반응완료액을 여과하여 Ⅳ-1, Ⅳ-4 구분 없이 바로 pH 5.9, 에탄올 농도 40%, 온도 -10℃로 Fraction Ⅳ공정을 진행한 경우(분획방법 1) PKA activity수치가 평균 19.2 IU/mL이었고, 분획방법 2로 진행한 검체는 평균 8.5 IU/mL로서 제제기준인 35 IU/mL와 비교 했을 때 24.3% 수준의 낮은 결과를 보였다. 에탄올과 염 및 기타 불순 단백질을 제거하기 위해 실시하는 한외여과 공정에서 사용되는 투석용액을 1.1% NaCl용액과 주사용수로 하여 첫 번째 조건으로 각각 투석 교체용량의 5.5배, 1.5배 사용한 경우 알루미늄 금속이온 제거율이 94%였으며, 두 번째, 1.1% NaCl용액과 주사용수를 각각 투석 교체용량의 3배, 4배 사용한 경우는 97.7%가 제거되었다. 세 번째, 주사용수만 투석 교체용량의 7배 투입한 경우는 상대적으로 낮은 81.4%를 나타냈다. 결과를 볼 때 세 조건 모두 유럽약전 기준인 200 ppb 이하의 값을 보였으나 교체 투석액으로 NaCl용액을 3배 이상 사용하는 것이 많은 양의 알루미늄 이온을 제거시키는데 효과가 있었다. 분획 Ⅴ(알부민 침전물)를 대상으로 COHN 분획 VR 반응조건을 달리해 정제방법 2 조건대로 단백질 농도 3%, 에탄올 농도 12%, 이온강도 0.01, 온도 -3℃ 에서 공정을 진행한 결과 반응용액의 여과 전후 탁도 변화가 127 NTU에서 8.6 NTU로 90%이상 낮아져 여과를 통해 상당한 양의 이물질들이 제거되었고 그와 더불어 바이러스 불활화를 위한 열처리공정 전, 후의 반응용액 내 중합물(trimer)값을 비교해 보아도 각각 0.7%, 5.43%로 정제방법 1의 1.09%, 7.3%보다 낮았고, Heme 함량도 5.43으로 정제방법 1의 7.3보다 낮아 정제도 면에서 좋은 결과를 보였다. 알부민 용액에 함유된 발열성 유발물질인 endotoxin을 제거하기 위해 처리되는 알부민 용액의 농도를 10%와 20%로 나누고 각각에 대해 이온강도를 0, 0.07, 0.14로 맞춘 뒤 약 음이온교환수지인 DEAE Sephadex A50 Resin을 0.5%와 0.1%씩 처리하였다. 정제 결과 알부민 농도에 상관없이 resin을 최종농도 기준으로 0.5%로 처리했을 시 음이온을 띠는 endotoxin입자가 더 많이 흡착 분리되어 95%정도의 제거 효과를 보였고, resin 처리비율이 0.1%로 낮은 경우 이온강도가 낮을수록 endotoxin 제거율이 높았다.
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