초록 ▼

혈장으로 만드는 의약품은 pooling된 수 많은 공혈자 혈장을 원료로 하여 생산되기 때문에 전혈 또는 성분 수혈의 경우보다 바이러스 등의 전염성 질환에 노출될 확률이 크다. 혈장분획제제는 대부분 국가 주도로 관리를 하고 있으나 지속적으로 HIV, HAV, HCV, HBV, Parvovirus B19 등 각종 바이러스 감염이 문제점으로 제기 되어 오고 있어 체계적으로 혈액제제를 관리할 수 있는 품질 평가기술과 안전성 확보를 위한 평가기술 개발이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 혈장분획제제의 제조공정 중 내재 되어있는 바이러스 등

혈장으로 만드는 의약품은 pooling된 수 많은 공혈자 혈장을 원료로 하여 생산되기 때문에 전혈 또는 성분 수혈의 경우보다 바이러스 등의 전염성 질환에 노출될 확률이 크다. 혈장분획제제는 대부분 국가 주도로 관리를 하고 있으나 지속적으로 HIV, HAV, HCV, HBV, Parvovirus B19 등 각종 바이러스 감염이 문제점으로 제기 되어 오고 있어 체계적으로 혈액제제를 관리할 수 있는 품질 평가기술과 안전성 확보를 위한 평가기술 개발이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 혈장분획제제의 제조공정 중 내재 되어있는 바이러스 등 기타 위해인자 검출방법을 개발 확립함으로서 혈장분획제제의 안전성을 확보하고자하였다. 또한 새로이 확립된 시험법을 기존 방법과 비교하여 시험법도입에 대한 적정성을 검토하고자하였다. 이를 위해 혈장분획제제 제조공정 중 파보바이러스 B19 DNA 제거 검증을 위한 정량법 확립 및 검증 연구, HIV 불활화 및 제거 검증을 위한 검증시스템 확립 연구, 핵산증폭시험을 이용한 HBV DNA 검출법의 확립 및 검증 연구, 혈액제제 공정 중 적합한 endotoxin 시험법 확립 및 검증 연구 등을 수행하였다 그 결과 다음과 같은 결과를 도출하였다.
1) 혈장유래바이러스 중 물리 화학적 처리에 가장 큰 저항성을 나타내는 human parvovirus B19을 대상으로 internal control을 이용한 real-time PCR 정량법을 확립하였다. 정량법의 민감성, 특이성, 재현성, 정량한계 등을 검증하였다. 확립된 정량법을 이용하여 혈장분획제제 제조공정 중 파보바이러스 B19 DNA 제거 검증을 위한 시스템을 구축하고, 구축된 검증 시스템을 생산공정에 적용하여 검증 시스템의적합성을 확인하였다. 2) 혈장분획제제 안전성 검증에 필수적인 항목인 HIV 불활화 및 제거 검증을 검증시스템을 구축하였다. HIV-l strain HXB2의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포를 사용하였다. 세포배양법을 이용하여 정량법을 확립하고, 확립된 검증법의 신뢰성(Reliability)을 보증하기 위해 실험법의 민감도, 재현성, 정확성을 검증하였다. 생산공정에서 HIV 제거 및 불활화 검증을 통한 검증 시스템 적합성 을 평가하였다. 3) 혈장/공혈혈액에서 핵산증폭시험을 통한 HBV DNA 검사 (HBV NAT)의 유용성과 문제점을 여러 가지 검사법과 대조물질로 시험 분석하고, 이를 기존의 상업화된 검출법과 비교 평가하여 HBV의 검출방법을 확립하였다. 본 과제를 통해 헌혈혈액 및 혈장에 대한 HBV-NAT를 정립하였다. HBV NAT는 real-time PCR 법과 같은 높은 민감도의 검사법으로, 6 pool 이하로 시행함이 권장되며, 이때 기존의 혈청학적 방법보다 window period를 평균 29.3일 단축할 수 있어, 보다 안전한 혈액과혈장의 공급이 가능할 것으로 판단된다. 4)발열물질로 알려진 엔도톡신(내독소)이 혈액제제 등에 혼입 될 경우 심한 부작용을 일으킬 수 있다. 공정물질에 대한 발열성 물질 시험을 토끼 발열 테스트로 하는 것은 감도, 경제성 등에 많은 문제가 있다. 대체할 시험방법으로 감도가 좋고 간편한 시험 방법인 LAL시험을 알부민, 면역글로불린, 혈액응고8인자제제 공정물질에 적용할 수 있게 시험방법 및 조건을 정립하였고 엔도톡신 규격치도 설정하였다. 엔도톡신이 가해진 검체을 이용하여 토끼 발열 시험과 LAL 시험의 결과를 비교하여 상관관계를 검토하여 LAL 시험으로 대처가능성을 확인하였다. 5) 확립한 시험법을 표준화하기 위한 SOP를 작성 하였다.

Abstract ▼

Because plasma-derived proteins are manufactured from human plasma, special precautions must be taken during the production of these proteins to assure against the possibility of the products transmitting infectious diseases to the recipients. For a long time, the major risk associated with the use

Because plasma-derived proteins are manufactured from human plasma, special precautions must be taken during the production of these proteins to assure against the possibility of the products transmitting infectious diseases to the recipients. For a long time, the major risk associated with the use of blood products has been viral infections, such as Hepatitis A, B, C, and G, Human immunodeficiency virus (HIV), Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) I and II, and parvoviruses B19 (B19). Viral safety of the products is ensured through complementary manufacturing and quality control measures that include control of raw materials, validation and Implementation of effective virus clearance technology, and monitoring of final-filled product for the presence of virus. B19 is a small non-enveloped virus that is known to be highly resistant to physico-chemical treatments. Owing to the lack of a suitable cultivation and/or detection system for B19, model viruses such as porcine parvovirus, bovine parvovirus, and canine parvovirus have been used for validation study of B19 clearance. Recently, quantitative real-time PCR method has been recommend for an alternative to the infectivity assay using $TCID_{50}$ or plaque forming unit. Through this study, a quantitative real-time PCR using competitive internal control was developed for validation of B19 clearance and then successfully applied to the validation of B19 removal during the chromatography processes for plasma-derived products. Also a validated quantitative infectivity assay for the validation of HIV clearance was developed using HIV-1 strain HXB2 and C8166-45 cells grown in RPMI 1640 medium. HIV-1 was titrated using a quantal 50% tissue culture infectious dose $(TCID_{50})$ assay. The precision, accuracy, ruggedness, linearity, and limit of quantitation was validated. The infectivity assay was successfully applied to the validation of several processes for the manufacture of plasma derivatives. We also established nucleic acid amplification test by real-time PCR to detect hepatitis B virus in donated blood and source plasma. Highly sensitive and precise real-time PCR with 6 or less minipool can reduce the window period by 29.3 days compared to the serologic tests. Implementation of HBV NAT will increase the safety of blood transfusion and blood products in Korea. Blood products containing endotoxin, a subset of pyrogenic materials, cause severe fever when administered to patients. The rabbit pyrogen test is of little use as an in process control because it is very laborious and has a low sensitivity, Limulus amebocyte lysate(LAL) assay was developed and validated to apply to in process materials of albumin, immunoglobulin and coagulant factor VIII that endotoxin limits were established. The comparative results of LAL and rabbit pyrogen test showed that LAL test is considered useful for in process control of plasma fractions.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과 요약문...5
• 한글요약문...5
• 영문요약문...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...7
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...7
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...13
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...16
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...22
• 1) 제1세부과제 : 혈장분획제제 제조공정 중 파보바이러스 B19 DNA 제거 검증을 위한 정량법 확립 및 검증 연구...22
• 2) 제2세부과제 : HIV 검증 시스템 구축 및 활용...22
• 3) 제3세부과제 : 핵산증폭시험을 이용한 HBV DNA 검출법의 확립 및 검증...23
• 4) 제4세부과제 : 혈장분획제제 공정에서의 엔도톡신 시험 적용에 대한 연구...23
• 제3장 총괄연구개발파제의 최종 연구개발 결과...25
• 3.1. 제1세부과제 최종 연구개발 결과 (혈장분획제제 제조공정 중 파보바이러스 B19 DNA 제거 검증을 위한 정량법 확립 및 검증 연구)...25
• 3.2. 제2세부과제 최종 연구개발 결과 (HIV 검증 시스템 구축 및 활용)...26
• 3.3. 제3세부과제 최종 연구개발 결과 (핵산증폭시험을 이용한 HBV DNA 검출법의 확립 및 검증)...27
• 3.4. 제4세부과제 최종 연구개발 결과 (혈장분획제제 공정에서의 엔도톡신 시험 적용에 대한 연구)...27
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...29
• 4.1. 제1세부과제 연구결과 고찰 및 결론...29
• 4.2. 제2세부과제 연구결과 고찰 및 결론...31
• 4.3. 제3세부과제 연구결과 고찰 및 결론...32
• 4.4. 제4세부과제 연구결과 고찰 및 결론...34
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...36
• 5.1 활용성과...36
• 5.2 활용계획...37
• 제6장 기타 중요변경사항...38
• 제7장 참고문헌...39
• 제8장 첨부서류...42
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과...43
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...44
• 1.1 세부연구개발과제의 목표...44
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도...48
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...49
• 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...59
• 2.1. 연구의 이론적 배경...59
• 2.2. 연구방법...60
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...66
• 3.1. 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 parvovirus B19 제거 검증에 대한 관리 지침의 검토...66
• 3.2. 혈장 또는 혈장분획제제에서 B19 DNA 검출에 관한 문헌적 고찰...67
• 3.3. 혈장분획제제 제조공정에서 parvovirus B19 제거 및 불활화 방법의 효율성에 관한 문헌적 고찰...70
• 3.4. B19 DNA의 검출을 위한 Real time PCR...71
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...86
• 제5장 세부연구개발과제의 연구성과...89
• 5.1 활용성과...89
• 5.2 활용계획...90
• 제6장 기타 중요변경사항...90
• 제7장 참고문헌...91
• 제8장 첨부서류...95
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과...106
• 제1장 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...107
• 1.1 제2세부 연구개발과제의 목표...107
• 1.2 제 2세부 연구개발과제의 목표달성도...108
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...109
• 제2장 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...111
• 2.1 연구내용...111
• 2.2. 연구방법...120
• 제3장 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...134
• 3.1 미국, 유럽 등 외국 및 국제기구의 관리 지침의 검토 및 분석...134
• 3.2. 안전성 검증에 사용되는 HIV와 숙주세포주의 배양법 확립...134
• 3.3. 바이러스(HIV)와 세포주 banking...134
• 3.4. 검증법의 Method Validation...137
• 3.5. 생산공정의 바이러스 안전성 검증...139
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...146
• 4.1. HIV 배양 시험법...146
• 4.2. 검증시험법의 검증...147
• 4.3. 혈액제제 공정의 바이러스 검증...148
• 제5장 제2세부연구개발과제의 연구성과...150
• 5.1 활용성과...150
• 5.2 활용계획...151
• 제6장 기타 중요변경사항...153
• 1) 연구내용 및 범위중 검증대상공정의 변경...153
• 2) 기타...153
• 제7장 참고문헌...154
• 제8장 첨부서류...159
• V. 제 3 세부연구개발과제 연구결과...166
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...167
• 1.1 세부연구개발과제의 목표...167
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도...167
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...167
• 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...171
• 2.1. Window period 분석을 위한 sero-conversion panel의 선별과 확립...171
• 2.2. Pooling 수 확립과 대상검체의 희석...171
• 2.3. 최종 분석대상 검체의 확립과 보관...171
• 2.4. NAT 검사...171
• 2.5. NAT 검사의 window period 단축 효과 및 적절한 minipool size의 평가...172
• 2.6. NAT 검사의 검출한계 분석법의 확립과 민감도 및 정밀도의 평가...172
• 2.7. 혈청학적 검사...172
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...173
• 3.1 Seroconversion panel에서 NAT, CMIA, EIA 분석의 종합결과...173
• 3.2. NAT 검사를 통한 window period의 단축효과...173
• 3.3. NAT 검사의 적절한 minipool size...173
• 3.4. HBV-DNA 양과 CMIA, EIA의 검출율의 비교...173
• 3.5. NAT 검사법의 검출한계 및 정밀도 분석...173
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...177
• 4.1. 고찰...177
• 4.2 결론...177
• 제5장 세부연구개발과제의 연구성과...179
• 5.1 활용성과...179
• 5.2 활용계획...180
• 제6장 기타 중요변경사항...180
• 제7장 참고문헌...181
• 제8장 첨부서류...182
• Vl. 제4세부연구개발과제 연구결과...183
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...184
• 1.1 세부연구개발과제의 목표...184
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도...185
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...186
• 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...187
• 2.1연구내용...187
• 2.2 연구방법...187
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...195
• 3.1 엔도톡신 규격치(안) 설정...195
• 3.2 엔도톡신 시험 스크린 및 엔도톡신 영향 물질 평가...196
• 3.3 엔도톡신 시험법 검증...201
• 3.4 LAL, In vitro pyrogen test 및 발열 시험 비교 결과...205
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...208
• 제5장 세부연구개발과제의 연구성과...210
• 5.1 활용성과...210
• 5.2 활용계획...211
• 제6장 기타 중요변경사항...211
• 제7장 참고문헌...212
• 제8장 첨부서류...214
• 총괄 연구과제 요약...215
• 1 세부 연구과제 요약...217
• 2 세부 연구과제 요약...219
• 3 세부 연구과제 요약...221
• 4 세부 연구과제 요약...223