목 적 외상에 의해 골절이 발생하면 혈관 손상으로 인해 혈액 공급이 차단되어 저산소증이 유발된다. 이런 환경에서 조골세포와 연골세포에 의하여 막내 골화와 연골내 골화를 통하여 골절이 치유되며, 이는 VEGF에 의한 신생혈관의 형성이 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 저산소증은 VEGF의 발현을 촉진할 것으로 추정된다. 그리고 저산소증에서 발현되는 HIF-1α와 HIF-2α가 VEGF의 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 그러나 HIF가 골절에 관여하는 여부 및 막내 골화 또는 연골내 골화 중 어느 부분에 관여하는가에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구는 저산소 분압에서의 세포 배양과 백서 골절 모델을 통하여 연골세포와 조골세포의 HIF-1α와 HIF-2α 및 VEGF의 발현과 기전에 대해서 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 사람의 뼈와 관절연골에서 추출한 조골세포와 연골세포, 백서의 골수기질세포인 ST2세포를 10% FBS가 첨가된 DME/F12 배양액에서 배양하였다. 그리고 DME/F12 배양액을 95% N₂와 5% CO₂조성의 ...
목 적 외상에 의해 골절이 발생하면 혈관 손상으로 인해 혈액 공급이 차단되어 저산소증이 유발된다. 이런 환경에서 조골세포와 연골세포에 의하여 막내 골화와 연골내 골화를 통하여 골절이 치유되며, 이는 VEGF에 의한 신생혈관의 형성이 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 저산소증은 VEGF의 발현을 촉진할 것으로 추정된다. 그리고 저산소증에서 발현되는 HIF-1α와 HIF-2α가 VEGF의 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 그러나 HIF가 골절에 관여하는 여부 및 막내 골화 또는 연골내 골화 중 어느 부분에 관여하는가에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구는 저산소 분압에서의 세포 배양과 백서 골절 모델을 통하여 연골세포와 조골세포의 HIF-1α와 HIF-2α 및 VEGF의 발현과 기전에 대해서 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 사람의 뼈와 관절연골에서 추출한 조골세포와 연골세포, 백서의 골수기질세포인 ST2세포를 10% FBS가 첨가된 DME/F12 배양액에서 배양하였다. 그리고 DME/F12 배양액을 95% N₂와 5% CO₂조성의 혼합가스로 1시간 동안 처리하여 산소분압을 60mmHg 이하로 만들고, 이를 계속 유지하며 배양중인 조골세포와 연골세포, ST2 세포에 첨가하였다. 2, 6, 24시간 후 total RNA와 단백질을 추출하여 HIF-1α, HIF-2α, VEGF의 발현에 대해 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 확인하였고, 면역조직화학 염색도 일부 시행하였다. 또한 HIF-1α에 대한 siRNA를 처치하여 VEGF의 발현을 관찰하였다. 9주령 SD 백서의 대퇴골을 골절시키고 3, 5, 7, 10, 14, 21일 경과 후 가골을 채취하여 Western blot analysis를 통해 HIF-1α의 발현을 관찰하였고, RT-PCR을 통하여 VEGF의 발현을 관찰하였다 결 과 저산소 분압 상태의 조골세포와 연골세포에 대해 RT-PCR을 실시한 결과, HIF-1α, HIF-2α는 정상군과 큰 차이가 없었으나, VEGF는 정상군보다 현저히 증가되었다. Western blot analysis에서는 저산소 분압 상태에서 정상군보다 HIF-1α, HIF-2α의 발현이 크게 증가하였다. siRNA로 HIF를 억제한 결과 HIF뿐 아니라 VEGF의 발현도 감소하였다. 백서의 가골에서 HIF-1α와 VEGF의 발현을 분석한 결과 골절 후 5일에서 7일까지 최대치를 보이다가 10일 이후 급격하게 감소하였다. HIF-1α는 세포 배양 실험과는 달리 RT-PCR에서 mRNA의 발현이 골절 후 7일째 최고조로 증가하는 양상을 보였다 결 론 HIF-1α와 VEGF의 발현은 골절 치유 과정 중 골절 후 5-7일에 최고조를 보이고, 가골에서 산소 분압이 다시 높아지면서 감소하는 양상을 보였다. 골모세포와 연골세포는 저산소 상태에서 HIF 단백이 증가하였는데 이는 post-translational modification에 의하여 이루어지는 반면, 가골에서는 저산소증 뿐만 아니라 성장 인자와 같은 다른 인자에 의해 조절받아 HIF의 mRNA 발현이 증가된다고 판단된다. 향후 가골에서 저산소 이외에 작용하는 인자들을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다. 색인단어: HIF-1α, VEGF, 골절 치유
목 적 외상에 의해 골절이 발생하면 혈관 손상으로 인해 혈액 공급이 차단되어 저산소증이 유발된다. 이런 환경에서 조골세포와 연골세포에 의하여 막내 골화와 연골내 골화를 통하여 골절이 치유되며, 이는 VEGF에 의한 신생혈관의 형성이 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 저산소증은 VEGF의 발현을 촉진할 것으로 추정된다. 그리고 저산소증에서 발현되는 HIF-1α와 HIF-2α가 VEGF의 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 그러나 HIF가 골절에 관여하는 여부 및 막내 골화 또는 연골내 골화 중 어느 부분에 관여하는가에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구는 저산소 분압에서의 세포 배양과 백서 골절 모델을 통하여 연골세포와 조골세포의 HIF-1α와 HIF-2α 및 VEGF의 발현과 기전에 대해서 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 사람의 뼈와 관절연골에서 추출한 조골세포와 연골세포, 백서의 골수기질세포인 ST2세포를 10% FBS가 첨가된 DME/F12 배양액에서 배양하였다. 그리고 DME/F12 배양액을 95% N₂와 5% CO₂조성의 혼합가스로 1시간 동안 처리하여 산소분압을 60mmHg 이하로 만들고, 이를 계속 유지하며 배양중인 조골세포와 연골세포, ST2 세포에 첨가하였다. 2, 6, 24시간 후 total RNA와 단백질을 추출하여 HIF-1α, HIF-2α, VEGF의 발현에 대해 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 확인하였고, 면역조직화학 염색도 일부 시행하였다. 또한 HIF-1α에 대한 siRNA를 처치하여 VEGF의 발현을 관찰하였다. 9주령 SD 백서의 대퇴골을 골절시키고 3, 5, 7, 10, 14, 21일 경과 후 가골을 채취하여 Western blot analysis를 통해 HIF-1α의 발현을 관찰하였고, RT-PCR을 통하여 VEGF의 발현을 관찰하였다 결 과 저산소 분압 상태의 조골세포와 연골세포에 대해 RT-PCR을 실시한 결과, HIF-1α, HIF-2α는 정상군과 큰 차이가 없었으나, VEGF는 정상군보다 현저히 증가되었다. Western blot analysis에서는 저산소 분압 상태에서 정상군보다 HIF-1α, HIF-2α의 발현이 크게 증가하였다. siRNA로 HIF를 억제한 결과 HIF뿐 아니라 VEGF의 발현도 감소하였다. 백서의 가골에서 HIF-1α와 VEGF의 발현을 분석한 결과 골절 후 5일에서 7일까지 최대치를 보이다가 10일 이후 급격하게 감소하였다. HIF-1α는 세포 배양 실험과는 달리 RT-PCR에서 mRNA의 발현이 골절 후 7일째 최고조로 증가하는 양상을 보였다 결 론 HIF-1α와 VEGF의 발현은 골절 치유 과정 중 골절 후 5-7일에 최고조를 보이고, 가골에서 산소 분압이 다시 높아지면서 감소하는 양상을 보였다. 골모세포와 연골세포는 저산소 상태에서 HIF 단백이 증가하였는데 이는 post-translational modification에 의하여 이루어지는 반면, 가골에서는 저산소증 뿐만 아니라 성장 인자와 같은 다른 인자에 의해 조절받아 HIF의 mRNA 발현이 증가된다고 판단된다. 향후 가골에서 저산소 이외에 작용하는 인자들을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다. 색인단어: HIF-1α, VEGF, 골절 치유
Purpose It is well-known that fracture site is hypoxic as local vasculature is severed. In hypoxic environment, fracture healing occurs in the process called enchondral ossification and intramembranous ossification. During fracture healing, angiogenesis mediated by VEGF is very important. Recently r...
Purpose It is well-known that fracture site is hypoxic as local vasculature is severed. In hypoxic environment, fracture healing occurs in the process called enchondral ossification and intramembranous ossification. During fracture healing, angiogenesis mediated by VEGF is very important. Recently reported transcriptional factor, HIF-1α and HIF-2α is master regulator of hypoxia inducible genes including VEGF. To elucidate the relation between fracture healing and angiogenesis, we checked expression of HIF and VEGF using hypoxic cell culture and callus from rat femur fracture model. Materials and Methods Human osteoblasts, chondrocytes and rat ST2 cells were cultured in DME/F12 media with 10% FBS. DME/F12 media was bubbled with 95% N₂and 5% CO₂. This hypoxic media(PO2<60mmHg) was added to the cells. After 2, 6, 24 hours, RNA and proteins were collected for RT-PCR and western blot. In addition, immunocytochemistry and siRNA treatment for HIF-1α were performed. Next, 9-weeks SD rat femurs were fractured after fixed with K-wire. The rats were sacrificed at post-fracture day(PFD) 3, 5, 7, 10, 14, 21 and collected calluses for RT-PCR and western blot. Results HIF-1α and HIF-2α expression was not increased in RT-PCR but enhanced in western blot. VEGF expression in RT-PCR was increased. As HIF was inhibited siRNA, VEGF expression was decreased. In the rat fracture callus, HIF-1α and VEGF expression showed peak between PFD 5 and 7 and decreased after PFD 10. In contrast to cell culture, mRNA expression of HIF-1α was increased at PFD 7. Conclusions HIF-1α and VEGF was involved throughout the fracture healing and peak expression was in early stage. In fracture callus, the expression was decreased as O2 tension increased. Further study is needed for another factor for chondrogenic differention. Key Words: HIF-1α, VEGF, Fracture healing
Purpose It is well-known that fracture site is hypoxic as local vasculature is severed. In hypoxic environment, fracture healing occurs in the process called enchondral ossification and intramembranous ossification. During fracture healing, angiogenesis mediated by VEGF is very important. Recently reported transcriptional factor, HIF-1α and HIF-2α is master regulator of hypoxia inducible genes including VEGF. To elucidate the relation between fracture healing and angiogenesis, we checked expression of HIF and VEGF using hypoxic cell culture and callus from rat femur fracture model. Materials and Methods Human osteoblasts, chondrocytes and rat ST2 cells were cultured in DME/F12 media with 10% FBS. DME/F12 media was bubbled with 95% N₂and 5% CO₂. This hypoxic media(PO2<60mmHg) was added to the cells. After 2, 6, 24 hours, RNA and proteins were collected for RT-PCR and western blot. In addition, immunocytochemistry and siRNA treatment for HIF-1α were performed. Next, 9-weeks SD rat femurs were fractured after fixed with K-wire. The rats were sacrificed at post-fracture day(PFD) 3, 5, 7, 10, 14, 21 and collected calluses for RT-PCR and western blot. Results HIF-1α and HIF-2α expression was not increased in RT-PCR but enhanced in western blot. VEGF expression in RT-PCR was increased. As HIF was inhibited siRNA, VEGF expression was decreased. In the rat fracture callus, HIF-1α and VEGF expression showed peak between PFD 5 and 7 and decreased after PFD 10. In contrast to cell culture, mRNA expression of HIF-1α was increased at PFD 7. Conclusions HIF-1α and VEGF was involved throughout the fracture healing and peak expression was in early stage. In fracture callus, the expression was decreased as O2 tension increased. Further study is needed for another factor for chondrogenic differention. Key Words: HIF-1α, VEGF, Fracture healing
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