한국산 미역귀 유래 퓨코-다당류 정제, 특성 규명 및 미생물에 의한 분해 연구 (A) study on purification, characterization, and microbial degradation of fuco-polysaccharide isolated from Korean Undaria pinnatifida sporophyll원문보기
갈조류에는 Ca를 비롯한 무기질과 다당류를 다량 함유하고 있으며, 알긴산은 그 대표적인 다당으로 현재 점증제등의 식품첨가물로 이용되고 있다. 또한 갈조류에는 중성다당인 laminaran과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있는 데 그 대표적인 함황 산성다당이 fucoidan 이다. Fucoidan은 갈조류의 ...
갈조류에는 Ca를 비롯한 무기질과 다당류를 다량 함유하고 있으며, 알긴산은 그 대표적인 다당으로 현재 점증제등의 식품첨가물로 이용되고 있다. 또한 갈조류에는 중성다당인 laminaran과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있는 데 그 대표적인 함황 산성다당이 fucoidan 이다. Fucoidan은 갈조류의 종마다 그 함량과 분자량이 매우 다르다. 본 연구에서 사용한 완도지역의 한국산 미역귀는 3.9%의 fucoidan을 함유하는 것으로 나타났다. 이 fucoidan은 DEAE-cellulose column chromatography로 정제하여 그 성분당 조성 및 화학적 조성, 항혈전 활성을 조사하였고, 이 퓨코이단을 분해하는 효소활성을 갖는 미생물을 자연계로부터 분리하여 동정하였다. 정제한 fucoidan의 분자량은 HPLC로 분석한 결과 2.1 X 103 kDa 으로 확인되었으며, 52.34% 중성당, 26.2% 유론산 그리고 7.4%의 황산기로 구성되어 있다. Column chromatography로 정제한 fucoidan의 단당류 성분은 fucose (72.3%), xylose (1.5%), galactose (14.6%) 그리고 mannose (10.9%)로 구성되어 있다. 그 결과 이 fucoidan은 황산기를 포함하는 U-type의 fucoidan으로 확인하였다. Fucoidan을 분해하는 fucoidanase는 해양 미생물에서 분리하였는데 이는 탄소원인 fucoidan을 포함하는 최소배지에서의 성장을 비교하여 분리하였다. 분리한 균은 16sDNA 서열을 분석하여 동정한결과 Sphingomonas 종으로 밝혀졌으며 PF-1으로 명하였다. PF-1은 fucoidan을 분자량 3,749Da 에서 305Da으로 fucose를 포함하는 다당으로 분해하였다. Fucoidan을 분해하는 효소는 PF-1의 표면에 존재하며, p-nitrophenyl-α-L-fucoside를 기질로 반응 시켰을 때, 반응을 하지 않는것으로 보아 exo-type의 활성이 아닌 endo-type의 효소활성을 보여주었다. The activated patial thrombloplastin time(APTT) 방법으로 본fucoidan의 약리활성 중 항혈전 효과를 조사한 결과, 본 실험에서 정제한 fucoidan 5μg과 다시마로부터 분리하여 시그마사(USA)가 시약용으로 판매하고 있는 fucoidan(Sigma, USA)을 비교해 보았을 때, 미역귀에서 추출한 fucoidan에서의 항혈전 효과가 1.5배정도 높은 효과를 보였다. 미역귀에서 추출한 정제 fucoidan을 농도별(0.1, 0.25, 1.0, 5.0 μg)로 항혈전 효과를 비교해 보면 fucoidan의 농도가 높을수록 항혈전 효과가 높게 나타났다. 이러한 결과는 한국산 유래 미역귀에서 추출한 fucoidan이 항혈전 효과가 우수하며 여러 부작용이 있는 heparin을 대체 할 수 있는 항혈전제로의 개발가능성이 있음을 보여주었다.
갈조류에는 Ca를 비롯한 무기질과 다당류를 다량 함유하고 있으며, 알긴산은 그 대표적인 다당으로 현재 점증제등의 식품첨가물로 이용되고 있다. 또한 갈조류에는 중성다당인 laminaran과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있는 데 그 대표적인 함황 산성다당이 fucoidan 이다. Fucoidan은 갈조류의 종마다 그 함량과 분자량이 매우 다르다. 본 연구에서 사용한 완도지역의 한국산 미역귀는 3.9%의 fucoidan을 함유하는 것으로 나타났다. 이 fucoidan은 DEAE-cellulose column chromatography로 정제하여 그 성분당 조성 및 화학적 조성, 항혈전 활성을 조사하였고, 이 퓨코이단을 분해하는 효소활성을 갖는 미생물을 자연계로부터 분리하여 동정하였다. 정제한 fucoidan의 분자량은 HPLC로 분석한 결과 2.1 X 103 kDa 으로 확인되었으며, 52.34% 중성당, 26.2% 유론산 그리고 7.4%의 황산기로 구성되어 있다. Column chromatography로 정제한 fucoidan의 단당류 성분은 fucose (72.3%), xylose (1.5%), galactose (14.6%) 그리고 mannose (10.9%)로 구성되어 있다. 그 결과 이 fucoidan은 황산기를 포함하는 U-type의 fucoidan으로 확인하였다. Fucoidan을 분해하는 fucoidanase는 해양 미생물에서 분리하였는데 이는 탄소원인 fucoidan을 포함하는 최소배지에서의 성장을 비교하여 분리하였다. 분리한 균은 16sDNA 서열을 분석하여 동정한결과 Sphingomonas 종으로 밝혀졌으며 PF-1으로 명하였다. PF-1은 fucoidan을 분자량 3,749Da 에서 305Da으로 fucose를 포함하는 다당으로 분해하였다. Fucoidan을 분해하는 효소는 PF-1의 표면에 존재하며, p-nitrophenyl-α-L-fucoside를 기질로 반응 시켰을 때, 반응을 하지 않는것으로 보아 exo-type의 활성이 아닌 endo-type의 효소활성을 보여주었다. The activated patial thrombloplastin time(APTT) 방법으로 본fucoidan의 약리활성 중 항혈전 효과를 조사한 결과, 본 실험에서 정제한 fucoidan 5μg과 다시마로부터 분리하여 시그마사(USA)가 시약용으로 판매하고 있는 fucoidan(Sigma, USA)을 비교해 보았을 때, 미역귀에서 추출한 fucoidan에서의 항혈전 효과가 1.5배정도 높은 효과를 보였다. 미역귀에서 추출한 정제 fucoidan을 농도별(0.1, 0.25, 1.0, 5.0 μg)로 항혈전 효과를 비교해 보면 fucoidan의 농도가 높을수록 항혈전 효과가 높게 나타났다. 이러한 결과는 한국산 유래 미역귀에서 추출한 fucoidan이 항혈전 효과가 우수하며 여러 부작용이 있는 heparin을 대체 할 수 있는 항혈전제로의 개발가능성이 있음을 보여주었다.
Crude fucoidan was extracted from the sporophyll of Korean Undaria pinnatifida, collected at a coastal area of Wando, Korea, mainly by dilute acid extraction, ethanol precipitation, and CaCl2 precipitation, with a yield of approximately 3.9% in mass. It was further purified by DEAE-cellulose column ...
Crude fucoidan was extracted from the sporophyll of Korean Undaria pinnatifida, collected at a coastal area of Wando, Korea, mainly by dilute acid extraction, ethanol precipitation, and CaCl2 precipitation, with a yield of approximately 3.9% in mass. It was further purified by DEAE-cellulose column chromatography and its chemical composition and in vitro anticoagulant activity was determined. The average molecular mass of the purified fucoidan was estimated about 2.1×103 kDa by size-fractionation HPLC. The purified fucoidan consisted of neutral sugar (52.34% in mass), uronic acid (26.2%), and sulfate esters (7.4%). From the HPAEC-PAD analysis, the monosaccharide composition of the purified fucoidan was shown to be fucose, galactose, xylose, and mannose, with a molar ratio of 1, 0.2, 0.02, and 0.15, respectively. The major monosaccharide was fucose (72.3% in mol percentage) and other sugars, xylose (1.5%), galactose (14.6%), and mannose (10.9%) were present as minor component. The results suggested that this fucoidan is a sulfated, U-type fucoidan. In spite of increasing interest in fucoidans as biologically active compounds, no convenient commercial sources with fucoidanase activity are available yet. A marine bacterial strain that showed confluent growth on the minimal medium containing fucoidan as the sole carbon source, was isolated. This strain was identified, based on the 16S rDNA sequence analysis, as a strain of Sphingomonas paucimobilis, thus named as Sphingomonas paucimobilis PF-1. This strain depolymerized fucoidan into at least more than 7 distinct low molecular weight fucose-containing oligosaccharides, ranging from 305 to 3,749 Da. However, the whole-cell enzyme preparation did not release L-fucose monomer from the fucoidan nor hydrolyze chromogenic substrate p-nitrophenyl-α-L-fucoside, indicating that this enzyme may be an endo-acting fucoidanase not α-L-fucosidase. The enzyme activity was shown to be associated with the whole cell, suggesting the possibility for the surface display of this enzyme. To the best of my knowledge, this is the first report on the fucoidanolytic activity of Sphingomonas species and also the first report on the enzymatic degradation of the Korean Undaria pinnatifida sporophyll fucoidans. This enzyme activity would be very useful not only for structural analyses of fucose-containing polysaccharides but also for the production of bioactive fuco-oligosaccharides. The activated partial thrombloplastin time (APTT) assay of the purified fucoidan showed that the purified fucoidan elicited significant anticoagulant activity in a dose-dependent manner. Five ug of sporophyll fucoidan delayed the blood clotting time approximately 5-times than untreated control and also 1.5-times than the same amount of the commercial fucoidan, respectively. Although it is preliminary, these results suggest that the fucoidan of Korean Undaria pinnatifida sporophyll would be promising candidates for the development of an anticoagulant.
Crude fucoidan was extracted from the sporophyll of Korean Undaria pinnatifida, collected at a coastal area of Wando, Korea, mainly by dilute acid extraction, ethanol precipitation, and CaCl2 precipitation, with a yield of approximately 3.9% in mass. It was further purified by DEAE-cellulose column chromatography and its chemical composition and in vitro anticoagulant activity was determined. The average molecular mass of the purified fucoidan was estimated about 2.1×103 kDa by size-fractionation HPLC. The purified fucoidan consisted of neutral sugar (52.34% in mass), uronic acid (26.2%), and sulfate esters (7.4%). From the HPAEC-PAD analysis, the monosaccharide composition of the purified fucoidan was shown to be fucose, galactose, xylose, and mannose, with a molar ratio of 1, 0.2, 0.02, and 0.15, respectively. The major monosaccharide was fucose (72.3% in mol percentage) and other sugars, xylose (1.5%), galactose (14.6%), and mannose (10.9%) were present as minor component. The results suggested that this fucoidan is a sulfated, U-type fucoidan. In spite of increasing interest in fucoidans as biologically active compounds, no convenient commercial sources with fucoidanase activity are available yet. A marine bacterial strain that showed confluent growth on the minimal medium containing fucoidan as the sole carbon source, was isolated. This strain was identified, based on the 16S rDNA sequence analysis, as a strain of Sphingomonas paucimobilis, thus named as Sphingomonas paucimobilis PF-1. This strain depolymerized fucoidan into at least more than 7 distinct low molecular weight fucose-containing oligosaccharides, ranging from 305 to 3,749 Da. However, the whole-cell enzyme preparation did not release L-fucose monomer from the fucoidan nor hydrolyze chromogenic substrate p-nitrophenyl-α-L-fucoside, indicating that this enzyme may be an endo-acting fucoidanase not α-L-fucosidase. The enzyme activity was shown to be associated with the whole cell, suggesting the possibility for the surface display of this enzyme. To the best of my knowledge, this is the first report on the fucoidanolytic activity of Sphingomonas species and also the first report on the enzymatic degradation of the Korean Undaria pinnatifida sporophyll fucoidans. This enzyme activity would be very useful not only for structural analyses of fucose-containing polysaccharides but also for the production of bioactive fuco-oligosaccharides. The activated partial thrombloplastin time (APTT) assay of the purified fucoidan showed that the purified fucoidan elicited significant anticoagulant activity in a dose-dependent manner. Five ug of sporophyll fucoidan delayed the blood clotting time approximately 5-times than untreated control and also 1.5-times than the same amount of the commercial fucoidan, respectively. Although it is preliminary, these results suggest that the fucoidan of Korean Undaria pinnatifida sporophyll would be promising candidates for the development of an anticoagulant.
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