돼지증식성회장염 (Porcine proliferative enteropathy, PPE)은 세포내 기생 세균인 Lawsonia intracellularis에 의해 발병하는 돼지 소모성 질병으로서 전 세계적으로 발병하고 있으며 막대한 경제적 손실을 유발하는 양돈 산업에 있어 중요한 질병이다. 본 질병은 대부분 6-20주령의 돼지에서 발생하는 특징을 갖고 있으며 설사, 출혈성설사, 괴사성설사, 체중감소, 사료섭취 감소 등의 증상을 보이며 심각한 경우에는 폐사하기도 한다. 본 질병의 원인체인 L. intracellularis 균은 Gram 음성균으로서 ...
돼지증식성회장염 (Porcine proliferative enteropathy, PPE)은 세포내 기생 세균인 Lawsonia intracellularis에 의해 발병하는 돼지 소모성 질병으로서 전 세계적으로 발병하고 있으며 막대한 경제적 손실을 유발하는 양돈 산업에 있어 중요한 질병이다. 본 질병은 대부분 6-20주령의 돼지에서 발생하는 특징을 갖고 있으며 설사, 출혈성설사, 괴사성설사, 체중감소, 사료섭취 감소 등의 증상을 보이며 심각한 경우에는 폐사하기도 한다. 본 질병의 원인체인 L. intracellularis 균은 Gram 음성균으로서 간균의 형태를 보이고 있으며 편성 세포내 기생세균으로 알려져 있다. L. intracellularis 균의 특징 중 하나는 인공배지에서 배양이 되지 않기 때문에 배양이 상당히 까다롭고 배양을 위해서는 반드시 IEC-18, McCoy, INT407과 같은 세포에 감염을 통해서만 배양이 가능한 세균으로 알려져 있다. 본 연구에서는 국내 양돈장 돼지증식성회장염의 감염율을 조사하고자, L. intracellularis 균의 유전자에 기초한 PCR 방법을 사용하여 경남지역 양돈장내 PPE 감염율을 조사하였다. 돼지증식성회장염 감염율 조사를 위해 경남 도내 양돈장 47곳을 방문하여 각 농장의 분변에 대한 PCR 검사를 수행해본 결과 농장의 감염율은 전체 47곳 중 25 곳의 농장이 양성 반응을 나타내어 53.2%의 높은 감염율을 나타내었다. 또한 각 농장의 개체별 감염율을 조사하기 위해 31곳의 농장에서 총 155개의 분변 가검물에 대한 PCR 검사에서 54개의 양성 반응이 나타나 개체 감염율은 35.2%의 비교적 높은 감염율을 확인 할 수 있었다. 감염율 조사에 이은 돼지증식성회장염의 원인체인 L. intracellularis 균의 배양법 확립 및 야외주의 분리를 이하여 PCR 검사에서 돼지증식성회장염 양성을 보인 농장을 방문하여, 재차 개체별 분변을 채취하여 PCR을 수행하고, 양성반응을 나타낸 돼지를 선별하여 부검을 수행하고, PPE 감염 시 L. intracellularis 균이 다량 존재하는 것으로 알려진 회장 부위를 채취하여 야외주의 순수 배양법을 확립하였다. 기존의 발표된 자료에 의하면 L. intracellularis 균의 순수 배양을 위해서 야외주를 세포 내 감염을 수행한 후, 밀폐용기를 이용한 진공상태의 유지, 수소 가스로의 교환 등 복잡한 절차가 요구되었으나 본 연구에서는 기존에 발표된 이러한 과정을 생략한 채, 원심분리기를 이용한 균의 감염을 수행하여 순수 배양이 성공적으로 수행됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과로서 5대 배양까지는 항생제가 첨가된 배지에서 배양이 가능하였고, 그 이후의 배양에서는 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 균의 증식이 인정되어, 순수한 L. intracellularis 균의 배양법이 확립되었음을 확인 하였다. 순수 분리된 L. intracellularis 균의 특성을 분석하기 위하여 L. intracellularis 균의 병원성 인자로 알려진 LsaA 단백에 대한 유전자 염기서열 및 amino acid 서열을 이미 발표된 균주와 비교 분석을 실시하였다. 이를 위해 L. intracellularis 야외 균주의 LsaA 유전자의 유무를 확인하기 위하여 LsaA 유전자에 대한 primer를 제작하여 PCR을 수행하여 본 결과, 야외주에도 LsaA 유전자가 존재함이 확인 되었고 PCR을 통해 증폭된 LsaA 유전자는 다시 염기배열을 확인하기 위하여 pMAL vector에 cloning을 수행하여 염기 서열을 확인해 본 결과 이미 발표된 균주와 비교하여 98% 이상의 상동성이 인정되었다. 또한 밝혀진 LsaA 유전자의 염기서열을 기초로 amino acid 서열을 확인해본 결과 기존 밝혀진 amino acid 서열과 비교하여 97% 이상의 상동성을 나타내었다. 또한 LsaA 단백의 분자량 조사를 위하여 야외주를 이용 immunoblotting을 수행하였다. 본 실험을 수행하기 위하여 사용된 항체는 LsaA amino acid 서열을 기초로 합성 LsaA peptide를 토끼면역을 수행하고 면역된 토끼의 혈청을 이용하여 야외주의 LsaA 단백과의 면역 반응을 유도하였다. 그 결과 기존에 밝혀진 27.4 kDa의 LsaA 단백이 Western blot 방법으로 확인 되었다. 본 결과를 토대로 국내 분리 L. intracellularis 균이 LsaA 단백을 발현 하는 것이 확인되었고, 이는 LsaA 단백이 중요 병원성 인자로 밝혀진 바, 국내 양돈장의 돼지증식성회장염을 유발하는데 LsaA 단백이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 현재까지 돼지증식성회장염의 진단을 위해 일반적으로 사용하고 있는 방법은 균의 DNA에 기초한 PCR 방법이 가장 널리 사용되고 있는 실정이다. 최근 혈청학적 진단방법의 개발에 많은 연구가 진행되고 있으나 아직까지 상용화 되어있는 진단방법은 개발되지 않은 실정이다. 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단으로 소개되고 있는 방법으로는 Immunohistochemistry, Indirect ELISA, ELISA, Immunofluorescent antibody 등이 소개되고 있으며 상당히 민감도가 높은 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 다양한 혈청학적 진단방법에 사용하고 있는 항원이나 항체는 L. intracellularis 균의 분리가 선행되고 야외주를 확보한 상태에서만 진단법이 가능하게 되기 때문에 전 세계적으로도 소수의 연구진에 의해서 보고가 이루어지고 있는 실정이다. 이러한 문제점을 개선하고자, 본 연구에서는 LsaA 합성 펩타이드를 이용 돼지증식성회장염 진단을 위한 항원 및 항체 생산에 이용하였다. PCR을 통해 PPE 감염돼지를 선별하고 감염돈으로부터 혈액 및 분변을 채취하여 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 직접형광 항체법을 수행하였다. 그 결과 PCR에서 양성 반응을 나타낸 25두의 돼지 분변에서 분리한 균이 모두 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 높은 면역 반응을 나타내었으며, 부검을 통해 얻어진 5두의 장관으로부터 얻어진 균과 높은 면역 반응이 나타남이 확인 되었다. 그러나 음성 대조군으로 사용된 25두의 PPE 음성 돼지에 대한 면역 반응은 거의 나타나지 않았으며 음성 돈 대조군으로 사용된 5두의 장관으로부터 분리한 균과 면역 반응이 나타나지 않아 돼지증식성회장염의 진단에 상당히 유효하게 사용될 것으로 사료된다. 직접 면역 형광 항체법 이외에 LsaA 합성 펩타이드를 항원으로 이용한 ELISA법을 확립하였다. 합성 펩타이드를 일정 양 항원으로 사용하고 PCR과 분변으로부터 분리한 직접형광항체법에서 양성으로 나타난 25두의 혈청을 이용 ELISA에 이용한 결과 양성돈의 경우 OD값이 0.24에서 0.59까지의 높은 반응이 나온 반면 음성 대조군으로 사용된 25두의 결과는 0.02에서 0.09까지의 낮은 반응이 나타난 것으로 밝혀졌다. 이상의 결과로서 경남도내 양돈장의 돼지증식성회장염은 농장 감염율이 50%이상의 높은 감염율을 나타내는 것으로 나타나 본 질병에 의한 경제적 손실이 상당히 클 것으로 사료되며, 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 근절 프로그램이 확립되어 있지 않은바, 이에 대한 정책 마련이 시급할 것으로 판단되어진다. 또한 현재까지 국내 분리 L. intracellularis 균에 대한 정확한 정보가 마련되어 있지 않은 현 시점에서 본 연구를 통해 국내 분리 야외주의 분리 및 배양법이 확립 될 수 있었다. 또한 분리주에 대한 특성 분석을 통하여 LsaA 단백이 돼지증식성회장염의 발병에 상당한 영향을 미칠 것으로 사료되어 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단기법이 마련되지 못하여 진단 상에 큰 어려움을 겪고 있었으나, 균주를 이용하는 대신 합성 펩타이드를 이용하여 혈청학적 진단기법이 마련되어 보다 경제적이고 유용한 진단 방법으로 활용될 것이다. 본 결과를 토대로 얻어진 야외주 및 합성 펩타이드를 활용한 혈청학적 진단기법은 국내 양돈장의 증식성회장염에 대한 예방대책 및 근절 프로그램 확립에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.
돼지증식성회장염 (Porcine proliferative enteropathy, PPE)은 세포내 기생 세균인 Lawsonia intracellularis에 의해 발병하는 돼지 소모성 질병으로서 전 세계적으로 발병하고 있으며 막대한 경제적 손실을 유발하는 양돈 산업에 있어 중요한 질병이다. 본 질병은 대부분 6-20주령의 돼지에서 발생하는 특징을 갖고 있으며 설사, 출혈성설사, 괴사성설사, 체중감소, 사료섭취 감소 등의 증상을 보이며 심각한 경우에는 폐사하기도 한다. 본 질병의 원인체인 L. intracellularis 균은 Gram 음성균으로서 간균의 형태를 보이고 있으며 편성 세포내 기생세균으로 알려져 있다. L. intracellularis 균의 특징 중 하나는 인공배지에서 배양이 되지 않기 때문에 배양이 상당히 까다롭고 배양을 위해서는 반드시 IEC-18, McCoy, INT407과 같은 세포에 감염을 통해서만 배양이 가능한 세균으로 알려져 있다. 본 연구에서는 국내 양돈장 돼지증식성회장염의 감염율을 조사하고자, L. intracellularis 균의 유전자에 기초한 PCR 방법을 사용하여 경남지역 양돈장내 PPE 감염율을 조사하였다. 돼지증식성회장염 감염율 조사를 위해 경남 도내 양돈장 47곳을 방문하여 각 농장의 분변에 대한 PCR 검사를 수행해본 결과 농장의 감염율은 전체 47곳 중 25 곳의 농장이 양성 반응을 나타내어 53.2%의 높은 감염율을 나타내었다. 또한 각 농장의 개체별 감염율을 조사하기 위해 31곳의 농장에서 총 155개의 분변 가검물에 대한 PCR 검사에서 54개의 양성 반응이 나타나 개체 감염율은 35.2%의 비교적 높은 감염율을 확인 할 수 있었다. 감염율 조사에 이은 돼지증식성회장염의 원인체인 L. intracellularis 균의 배양법 확립 및 야외주의 분리를 이하여 PCR 검사에서 돼지증식성회장염 양성을 보인 농장을 방문하여, 재차 개체별 분변을 채취하여 PCR을 수행하고, 양성반응을 나타낸 돼지를 선별하여 부검을 수행하고, PPE 감염 시 L. intracellularis 균이 다량 존재하는 것으로 알려진 회장 부위를 채취하여 야외주의 순수 배양법을 확립하였다. 기존의 발표된 자료에 의하면 L. intracellularis 균의 순수 배양을 위해서 야외주를 세포 내 감염을 수행한 후, 밀폐용기를 이용한 진공상태의 유지, 수소 가스로의 교환 등 복잡한 절차가 요구되었으나 본 연구에서는 기존에 발표된 이러한 과정을 생략한 채, 원심분리기를 이용한 균의 감염을 수행하여 순수 배양이 성공적으로 수행됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과로서 5대 배양까지는 항생제가 첨가된 배지에서 배양이 가능하였고, 그 이후의 배양에서는 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 균의 증식이 인정되어, 순수한 L. intracellularis 균의 배양법이 확립되었음을 확인 하였다. 순수 분리된 L. intracellularis 균의 특성을 분석하기 위하여 L. intracellularis 균의 병원성 인자로 알려진 LsaA 단백에 대한 유전자 염기서열 및 amino acid 서열을 이미 발표된 균주와 비교 분석을 실시하였다. 이를 위해 L. intracellularis 야외 균주의 LsaA 유전자의 유무를 확인하기 위하여 LsaA 유전자에 대한 primer를 제작하여 PCR을 수행하여 본 결과, 야외주에도 LsaA 유전자가 존재함이 확인 되었고 PCR을 통해 증폭된 LsaA 유전자는 다시 염기배열을 확인하기 위하여 pMAL vector에 cloning을 수행하여 염기 서열을 확인해 본 결과 이미 발표된 균주와 비교하여 98% 이상의 상동성이 인정되었다. 또한 밝혀진 LsaA 유전자의 염기서열을 기초로 amino acid 서열을 확인해본 결과 기존 밝혀진 amino acid 서열과 비교하여 97% 이상의 상동성을 나타내었다. 또한 LsaA 단백의 분자량 조사를 위하여 야외주를 이용 immunoblotting을 수행하였다. 본 실험을 수행하기 위하여 사용된 항체는 LsaA amino acid 서열을 기초로 합성 LsaA peptide를 토끼면역을 수행하고 면역된 토끼의 혈청을 이용하여 야외주의 LsaA 단백과의 면역 반응을 유도하였다. 그 결과 기존에 밝혀진 27.4 kDa의 LsaA 단백이 Western blot 방법으로 확인 되었다. 본 결과를 토대로 국내 분리 L. intracellularis 균이 LsaA 단백을 발현 하는 것이 확인되었고, 이는 LsaA 단백이 중요 병원성 인자로 밝혀진 바, 국내 양돈장의 돼지증식성회장염을 유발하는데 LsaA 단백이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 현재까지 돼지증식성회장염의 진단을 위해 일반적으로 사용하고 있는 방법은 균의 DNA에 기초한 PCR 방법이 가장 널리 사용되고 있는 실정이다. 최근 혈청학적 진단방법의 개발에 많은 연구가 진행되고 있으나 아직까지 상용화 되어있는 진단방법은 개발되지 않은 실정이다. 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단으로 소개되고 있는 방법으로는 Immunohistochemistry, Indirect ELISA, ELISA, Immunofluorescent antibody 등이 소개되고 있으며 상당히 민감도가 높은 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 다양한 혈청학적 진단방법에 사용하고 있는 항원이나 항체는 L. intracellularis 균의 분리가 선행되고 야외주를 확보한 상태에서만 진단법이 가능하게 되기 때문에 전 세계적으로도 소수의 연구진에 의해서 보고가 이루어지고 있는 실정이다. 이러한 문제점을 개선하고자, 본 연구에서는 LsaA 합성 펩타이드를 이용 돼지증식성회장염 진단을 위한 항원 및 항체 생산에 이용하였다. PCR을 통해 PPE 감염돼지를 선별하고 감염돈으로부터 혈액 및 분변을 채취하여 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 직접형광 항체법을 수행하였다. 그 결과 PCR에서 양성 반응을 나타낸 25두의 돼지 분변에서 분리한 균이 모두 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 높은 면역 반응을 나타내었으며, 부검을 통해 얻어진 5두의 장관으로부터 얻어진 균과 높은 면역 반응이 나타남이 확인 되었다. 그러나 음성 대조군으로 사용된 25두의 PPE 음성 돼지에 대한 면역 반응은 거의 나타나지 않았으며 음성 돈 대조군으로 사용된 5두의 장관으로부터 분리한 균과 면역 반응이 나타나지 않아 돼지증식성회장염의 진단에 상당히 유효하게 사용될 것으로 사료된다. 직접 면역 형광 항체법 이외에 LsaA 합성 펩타이드를 항원으로 이용한 ELISA법을 확립하였다. 합성 펩타이드를 일정 양 항원으로 사용하고 PCR과 분변으로부터 분리한 직접형광항체법에서 양성으로 나타난 25두의 혈청을 이용 ELISA에 이용한 결과 양성돈의 경우 OD값이 0.24에서 0.59까지의 높은 반응이 나온 반면 음성 대조군으로 사용된 25두의 결과는 0.02에서 0.09까지의 낮은 반응이 나타난 것으로 밝혀졌다. 이상의 결과로서 경남도내 양돈장의 돼지증식성회장염은 농장 감염율이 50%이상의 높은 감염율을 나타내는 것으로 나타나 본 질병에 의한 경제적 손실이 상당히 클 것으로 사료되며, 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 근절 프로그램이 확립되어 있지 않은바, 이에 대한 정책 마련이 시급할 것으로 판단되어진다. 또한 현재까지 국내 분리 L. intracellularis 균에 대한 정확한 정보가 마련되어 있지 않은 현 시점에서 본 연구를 통해 국내 분리 야외주의 분리 및 배양법이 확립 될 수 있었다. 또한 분리주에 대한 특성 분석을 통하여 LsaA 단백이 돼지증식성회장염의 발병에 상당한 영향을 미칠 것으로 사료되어 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단기법이 마련되지 못하여 진단 상에 큰 어려움을 겪고 있었으나, 균주를 이용하는 대신 합성 펩타이드를 이용하여 혈청학적 진단기법이 마련되어 보다 경제적이고 유용한 진단 방법으로 활용될 것이다. 본 결과를 토대로 얻어진 야외주 및 합성 펩타이드를 활용한 혈청학적 진단기법은 국내 양돈장의 증식성회장염에 대한 예방대책 및 근절 프로그램 확립에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.
Porcine proliferative enteropathy (PPE), caused by the obligate intracellular bacterium Lawsonia intracellularis is a widely distributed disease throughout the world causing substantial economic loss. Most frequently, the disease appears subclinically in pigs at 6?20 weeks of age with occasional non...
Porcine proliferative enteropathy (PPE), caused by the obligate intracellular bacterium Lawsonia intracellularis is a widely distributed disease throughout the world causing substantial economic loss. Most frequently, the disease appears subclinically in pigs at 6?20 weeks of age with occasional non-bloody diarrhea, decrease in the rate of weight gain, and weight loss. The pathogenic agent, L. intracellularis is gram negative, obligate intracellular bacteria and non-culturable in artificial medium, but culturable in several murine intestine derived cell line, such as IEC-18, McCoy, INT407 and so on. In this study, the prevalence of Lawsonia intracellularis, were investigated by molecular techniques PCR using fecal samples of pigs with diarrhea or a history of diarrhea in Gyeongnam province in Korea. Forty seven farms were investigated and overall herd prevalence of L. intracellularis, was 53.2% and the prevalence of L. intracellularis among all sampled pigs was 35.2%. To isolate wild type of L. intracellularis from pig, PCR-positive intestine lysate was infected in McCoy cell, and cultured until the 7th passages. From this result, the first pure isolation of L. intracellularis was established in Korea. The wild type of L. intracellularis was checked by molecular technique and immunostained method using rabbit anti-L. intracellularis and rabbit anti-LsaA polyclonal antibody. The characterization of wild type of L. intracellularis isolated from pig was performed. The DNA sequence and amino acid sequence homology comparison of LsaA, which is a high pathogenic protein, was tested, and resulted 98% homology and 97% homology to reference strain, respectively. The LsaA protein of isolated L. intracellularis was detected by immunoblotting assay. From this result, LsaA protein of isolated L. intracellularis was specifically reacted with rabbit anti-LsaA polyclonal antibody around 27.4 kDa region, suggesting that LsaA of L. intracellularis isolated from Korea would be an important role for pathogenic mechanism in PPE. To develope the serological diagnosis for PPE, the LsaA synthetic peptide was used for specific antigen. To synthesize LsaA peptide, non-cross reaction and specific predominant immunological epitope region of LsaA amino acid sequence was selected, and artificially synthesized. The synthetic LsaA peptide was infected in rabbit, anti-LsaA polyclonal antibody was produced. The synthetic peptide and anti-LsaA polyclonal antibody were used for PPE serological diagnosis as a specific antigen and antibody, respectively. To develop histoimmunostaining method, the intestine of naturally L. intracellularis infected pig were collected, fixed, stained with anti-LsaA polyclonal antibody and L. intracellularis was strongly reacted with anti-LsaA polyclonal antibody. This result was for the first time to detect L. intracellularis in the histoimmunostaining method using synthetic LsaA peptide. To develope a rapid serological diagnosis for PPE, direct fluorescence antibody test was performed using filtrated feces and intestine lysate. In this experiment, direct fluorescence antibody test showed a high sensitivity and rapid method for PPE diagnosis, suggesting that direct fluorescence antibody test would be a portable and economic diagnostic method for PPE. To develop a sensitive and available serological diagnosis method for PPE, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were performed. In this experiment, LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for L. intracellularis. Naturally L. intracellularis infected or not infected pig were selected by PCR, and blood samples were collected. LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for pig anti-L. intracellularis antibody. From this result, 25 sera of L. intracellularis infected pig showed high reactions with LsaA synthetic peptide. However, 25 sera of L. intracellularis free pig were not reacted with LsaA synthetic peptide. The optical density (OD) ranges were 0.24 to 0.62 in L. intracellularis infected pig and 0.01 to 0.09 in L. intracellularis free pig, respectively. From this result, it was confirmed that the critical OD range of cut off value for this ELISA was 0.1 at 492 nm. In conclusion, the prevalence of PPE in Gyeongnam province was more than 50% and it means the economic loss from PPE in pig farms would be more serious than other diseases of pig in Korea. Until now, specific eradication programs for PPE has not been established, so the economic loss would be increased in the future. In this study, wild type of L. intracellularis was isolated from pig and pure culture system was established. The bacterial characterizations, virulence factors, pathogenic mechanism, epidemiological agents and photogenic analysis are studied in the future. Moreover, this strain is able to be used for serological diagnostic method for PPE such as specific antigen, mono/poly-clonal antibody production, and be used for stable vaccine program establishment in Korea. Construction of serological diagnosis for PPE using synthetic peptide showed high sensitive diagnosis, suggested that LsaA synthetic peptide would be a useful material for PPE diagnosis such as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence antibody test, histoimmunochemistry test and so on.
Porcine proliferative enteropathy (PPE), caused by the obligate intracellular bacterium Lawsonia intracellularis is a widely distributed disease throughout the world causing substantial economic loss. Most frequently, the disease appears subclinically in pigs at 6?20 weeks of age with occasional non-bloody diarrhea, decrease in the rate of weight gain, and weight loss. The pathogenic agent, L. intracellularis is gram negative, obligate intracellular bacteria and non-culturable in artificial medium, but culturable in several murine intestine derived cell line, such as IEC-18, McCoy, INT407 and so on. In this study, the prevalence of Lawsonia intracellularis, were investigated by molecular techniques PCR using fecal samples of pigs with diarrhea or a history of diarrhea in Gyeongnam province in Korea. Forty seven farms were investigated and overall herd prevalence of L. intracellularis, was 53.2% and the prevalence of L. intracellularis among all sampled pigs was 35.2%. To isolate wild type of L. intracellularis from pig, PCR-positive intestine lysate was infected in McCoy cell, and cultured until the 7th passages. From this result, the first pure isolation of L. intracellularis was established in Korea. The wild type of L. intracellularis was checked by molecular technique and immunostained method using rabbit anti-L. intracellularis and rabbit anti-LsaA polyclonal antibody. The characterization of wild type of L. intracellularis isolated from pig was performed. The DNA sequence and amino acid sequence homology comparison of LsaA, which is a high pathogenic protein, was tested, and resulted 98% homology and 97% homology to reference strain, respectively. The LsaA protein of isolated L. intracellularis was detected by immunoblotting assay. From this result, LsaA protein of isolated L. intracellularis was specifically reacted with rabbit anti-LsaA polyclonal antibody around 27.4 kDa region, suggesting that LsaA of L. intracellularis isolated from Korea would be an important role for pathogenic mechanism in PPE. To develope the serological diagnosis for PPE, the LsaA synthetic peptide was used for specific antigen. To synthesize LsaA peptide, non-cross reaction and specific predominant immunological epitope region of LsaA amino acid sequence was selected, and artificially synthesized. The synthetic LsaA peptide was infected in rabbit, anti-LsaA polyclonal antibody was produced. The synthetic peptide and anti-LsaA polyclonal antibody were used for PPE serological diagnosis as a specific antigen and antibody, respectively. To develop histoimmunostaining method, the intestine of naturally L. intracellularis infected pig were collected, fixed, stained with anti-LsaA polyclonal antibody and L. intracellularis was strongly reacted with anti-LsaA polyclonal antibody. This result was for the first time to detect L. intracellularis in the histoimmunostaining method using synthetic LsaA peptide. To develope a rapid serological diagnosis for PPE, direct fluorescence antibody test was performed using filtrated feces and intestine lysate. In this experiment, direct fluorescence antibody test showed a high sensitivity and rapid method for PPE diagnosis, suggesting that direct fluorescence antibody test would be a portable and economic diagnostic method for PPE. To develop a sensitive and available serological diagnosis method for PPE, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were performed. In this experiment, LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for L. intracellularis. Naturally L. intracellularis infected or not infected pig were selected by PCR, and blood samples were collected. LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for pig anti-L. intracellularis antibody. From this result, 25 sera of L. intracellularis infected pig showed high reactions with LsaA synthetic peptide. However, 25 sera of L. intracellularis free pig were not reacted with LsaA synthetic peptide. The optical density (OD) ranges were 0.24 to 0.62 in L. intracellularis infected pig and 0.01 to 0.09 in L. intracellularis free pig, respectively. From this result, it was confirmed that the critical OD range of cut off value for this ELISA was 0.1 at 492 nm. In conclusion, the prevalence of PPE in Gyeongnam province was more than 50% and it means the economic loss from PPE in pig farms would be more serious than other diseases of pig in Korea. Until now, specific eradication programs for PPE has not been established, so the economic loss would be increased in the future. In this study, wild type of L. intracellularis was isolated from pig and pure culture system was established. The bacterial characterizations, virulence factors, pathogenic mechanism, epidemiological agents and photogenic analysis are studied in the future. Moreover, this strain is able to be used for serological diagnostic method for PPE such as specific antigen, mono/poly-clonal antibody production, and be used for stable vaccine program establishment in Korea. Construction of serological diagnosis for PPE using synthetic peptide showed high sensitive diagnosis, suggested that LsaA synthetic peptide would be a useful material for PPE diagnosis such as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence antibody test, histoimmunochemistry test and so on.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.