[학위논문]대장균의 숙신산 대사에 관련한 세포생리 연구 : 보충경로, 에너지 대사, 고농도 Cellular physiology studies on succinic acid metabolism of Escherichia coli : anaplerotic pathway, energy metabolism, high succinic acid tolerance원문보기
숙신산은 TCA 회로에서 4개의 탄소 디카르복시산 중에 하나이고 음식 첨가제, 의약품등 상업적 화합물과 전구체로 사용되어지고 있다. 일반적으로 숙신산은 석유 화학 공정에 의해서 생산이 이루어졌지만 이 방법은 환경 오염의 문제를 갖고 있기 때문에 많은 과학자들은 생물학적이고 자연친화적인 방법을 이용하여 숙신산을 생산하려는 노력을 행하고 있다. 이 연구는 C4 대사 생산을 강화하기 위해 혐기성 발효조건에서 대장균의 생리를 연구하였다. 먼저, 수행된 연구는 대장균내에서 C4 대사에 관여하는 보충경로 효소중 하나인 PEP carboxykinase (pck_(...
숙신산은 TCA 회로에서 4개의 탄소 디카르복시산 중에 하나이고 음식 첨가제, 의약품등 상업적 화합물과 전구체로 사용되어지고 있다. 일반적으로 숙신산은 석유 화학 공정에 의해서 생산이 이루어졌지만 이 방법은 환경 오염의 문제를 갖고 있기 때문에 많은 과학자들은 생물학적이고 자연친화적인 방법을 이용하여 숙신산을 생산하려는 노력을 행하고 있다. 이 연구는 C4 대사 생산을 강화하기 위해 혐기성 발효조건에서 대장균의 생리를 연구하였다. 먼저, 수행된 연구는 대장균내에서 C4 대사에 관여하는 보충경로 효소중 하나인 PEP carboxykinase (pck_(EC))발현을 유도하였다. 숙신산은 C3 대사물에 CO₂ 고정화에 의해서 합성이 유도되어지기 때문에 pck_(EC) 의 원활한 반응을 위해 NaHCO₃ 혹은 MgCO₃를 첨가하였고 NaHCO₃의 농도가 증가됨에 따라 숙신산 생산이 강화됨을 보였다. 특히 pck_(EC) 과발현한 균주에서 20 g./L의 NaHCO₃가 첨가되었을 때 숙신산 생산이 야생형 균주보다 2.2 배 증가를 나타내었다. 이 결과는 대장균내에서 gluconeogenic 의 pck_(EC)과발현과 동시에 높은 bicarbonate 공급으로 숙신산 생산이 강화되었음을 뒷받침하였다. 우리는 앞서 행한 동일한 실험 조건으로 나머지 보충 경로 효소들인 phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc), pyruvate carboxylase (pyc), NAD dependentmalic enzyme (maeA), 그리고 NADP-dependent malic enzyme (maeB)들의 과발현을 통해 숙신산 생산을 비교하였다. 그 결과 pck, maeB, ppc의 과발현 균주에서 숙신산의 생산이 각각 18.1 mM, 15.4 mM, 11 mM로 야생형 균주6.4 mM 보다 2-3배 증가됨을 알 수 있었으며 그 중에서도 C4 대사물의 비율이 maeB, pck를 발현한 균주에서 가장 많이 증가되었다. 그리고 보충경로에 동일한 반응에 관여하는 두 효소 glyconeogenic pck와 glycolytic ppc의 과발현을 통해서 세포내 에너지 변화를 살펴보았다. pck 반응은 PEP와 고정된 CO₂로 한 분자의 ATP를 생산해 내는 반응인데 반해 ppc는 Pi를 생산한다. 대장균내에 pck와 ppc의 과발현한 균주에서 각각 ATP를 측정하였고 pck 과발현 균주에서 야생형 균주와 ppc보다 ATP가 2배 정도 높은 것을 확인하였고 ppc 과발현 균주보다는 생장속도가 22% 느린 것을 알 수 있었다. pck 발현 균주와 ppc 발현 균주의 transcriptome 분석을 수행하였더니 building block 생합성, 에너지 대사에 관련된 유전자들의 up-regulation되었고 LB 배지에서 키운 pck 발현 균주에서는 특히 motility에 관여하는 유전자들이 강하게 발현되었다. pck 과발현 균주는 높은 에너지를 통해서 ppc 과발현 균주보다 biomolecule 등의 생합성 혹은 세포내 높은 에너지를 통해서 외부 단백질 생성에는 어떠한 영향이 있는지 계속해서 실험이 수행되어 지고 있다. 또한 높은 숙신산 스트레스에 대한 내성을 가진 균주 연구를 위해서 연속배양을 통해 9개월 동안 대장균을 배양하였다. 이렇게 최종 1.3 M 농도의 숙신산 스트레스에 적응되진 균주를 통해 transcriptome 분석을 통해서 유전자 대사 조절을 통해 높은 숙신산 농도에 대한 내성균주의 개발을 이루는데 도움이 될 것으로 여겨진다.
숙신산은 TCA 회로에서 4개의 탄소 디카르복시산 중에 하나이고 음식 첨가제, 의약품등 상업적 화합물과 전구체로 사용되어지고 있다. 일반적으로 숙신산은 석유 화학 공정에 의해서 생산이 이루어졌지만 이 방법은 환경 오염의 문제를 갖고 있기 때문에 많은 과학자들은 생물학적이고 자연친화적인 방법을 이용하여 숙신산을 생산하려는 노력을 행하고 있다. 이 연구는 C4 대사 생산을 강화하기 위해 혐기성 발효조건에서 대장균의 생리를 연구하였다. 먼저, 수행된 연구는 대장균내에서 C4 대사에 관여하는 보충경로 효소중 하나인 PEP carboxykinase (pck_(EC))발현을 유도하였다. 숙신산은 C3 대사물에 CO₂ 고정화에 의해서 합성이 유도되어지기 때문에 pck_(EC) 의 원활한 반응을 위해 NaHCO₃ 혹은 MgCO₃를 첨가하였고 NaHCO₃의 농도가 증가됨에 따라 숙신산 생산이 강화됨을 보였다. 특히 pck_(EC) 과발현한 균주에서 20 g./L의 NaHCO₃가 첨가되었을 때 숙신산 생산이 야생형 균주보다 2.2 배 증가를 나타내었다. 이 결과는 대장균내에서 gluconeogenic 의 pck_(EC)과발현과 동시에 높은 bicarbonate 공급으로 숙신산 생산이 강화되었음을 뒷받침하였다. 우리는 앞서 행한 동일한 실험 조건으로 나머지 보충 경로 효소들인 phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc), pyruvate carboxylase (pyc), NAD dependentmalic enzyme (maeA), 그리고 NADP-dependent malic enzyme (maeB)들의 과발현을 통해 숙신산 생산을 비교하였다. 그 결과 pck, maeB, ppc의 과발현 균주에서 숙신산의 생산이 각각 18.1 mM, 15.4 mM, 11 mM로 야생형 균주6.4 mM 보다 2-3배 증가됨을 알 수 있었으며 그 중에서도 C4 대사물의 비율이 maeB, pck를 발현한 균주에서 가장 많이 증가되었다. 그리고 보충경로에 동일한 반응에 관여하는 두 효소 glyconeogenic pck와 glycolytic ppc의 과발현을 통해서 세포내 에너지 변화를 살펴보았다. pck 반응은 PEP와 고정된 CO₂로 한 분자의 ATP를 생산해 내는 반응인데 반해 ppc는 Pi를 생산한다. 대장균내에 pck와 ppc의 과발현한 균주에서 각각 ATP를 측정하였고 pck 과발현 균주에서 야생형 균주와 ppc보다 ATP가 2배 정도 높은 것을 확인하였고 ppc 과발현 균주보다는 생장속도가 22% 느린 것을 알 수 있었다. pck 발현 균주와 ppc 발현 균주의 transcriptome 분석을 수행하였더니 building block 생합성, 에너지 대사에 관련된 유전자들의 up-regulation되었고 LB 배지에서 키운 pck 발현 균주에서는 특히 motility에 관여하는 유전자들이 강하게 발현되었다. pck 과발현 균주는 높은 에너지를 통해서 ppc 과발현 균주보다 biomolecule 등의 생합성 혹은 세포내 높은 에너지를 통해서 외부 단백질 생성에는 어떠한 영향이 있는지 계속해서 실험이 수행되어 지고 있다. 또한 높은 숙신산 스트레스에 대한 내성을 가진 균주 연구를 위해서 연속배양을 통해 9개월 동안 대장균을 배양하였다. 이렇게 최종 1.3 M 농도의 숙신산 스트레스에 적응되진 균주를 통해 transcriptome 분석을 통해서 유전자 대사 조절을 통해 높은 숙신산 농도에 대한 내성균주의 개발을 이루는데 도움이 될 것으로 여겨진다.
Succinic acid is one of four-carbon dicarboxylic acid metabolites involved in the TCA cycle. It is used as a commercial chemical, food additive and precursor of vitamin B 12, hemoglobin, etc. Usually, it is produced from petrochemical-based maleic acid, but this process has the disadvantage of causi...
Succinic acid is one of four-carbon dicarboxylic acid metabolites involved in the TCA cycle. It is used as a commercial chemical, food additive and precursor of vitamin B 12, hemoglobin, etc. Usually, it is produced from petrochemical-based maleic acid, but this process has the disadvantage of causing environmental pollution. Thus, many researchers have attempted to produce succinic acid using renewable resources. This study demonstrates the physiology of Escherichia coli (E. coli) during anaerobic fermentation to provide further environmentally safe strategies for the production of C4 metabolites. The first study conducted was the overexpression of gluconeogenic phophoenolpyruvate (PEP) carboxykinase of E. coli (pck_(EC)) among anaplerotic enzymes. Since succinic acid is synthesized by CO₂ fixation of C3 metabolites, supplementation of NaHCO₃or MgCO₃ enhanced the anaplerotic reaction. The overexpression of the pck_(EC) under anaerobic conditions enhanced succinic acid production as the NaHCO₃ concentration was increased. When 20 g/L of NaHCO₃ was added, succinic acid production in recombinant E. coli overexpressing PCK was 2.2-fold higher than that observed in the wild-type strain. It was concluded that the gluconeogenic pck_(EC) overexpression enabled E. coli to enhance succinic acid production only under high bicarbonate supplementation conditions. The second study involved an investigation into the formation of succinate through overexpression of various anaplerotic enzymes, including phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc), pyruvate carboxylase (pyc), NAD-dependent malic enzyme (maeA), and NADP-dependent malic enzyme (maeB), on E. coli. A remarkable increase in production of succinic acid was reported in E. coli overexpressing pck, maeB and ppc. The pck, maeB and ppc produced 18.1 mM, 15.4 mM and 11 mM of succinic acid, respectively, while the wild type produced 6.4 mM. The greatest increase in C4 metabolite ratio compared to the other tested enzymes was obtained with enhanced MaeB and Pck expression. The third study involved an investigation into the intracellular energy associated with pck and ppc expression. The gluconeogenic PCK and glycolytic PPC mediate the same reversible reactions of carboxylation of PEP (phosphoenopyruvate) into oxaloacetate. However, the PCK reaction produces one ATP molecule per one fixed carbon dioxide while the PPC reaction releases 1 mole of inorganic phosphate. The intracellular ATP levels were compared between E. coli overexpressing pck and ppc. The pck overexpressing E. coli was found to produce a 2-fold higher intracellular ATP pool than ppc overexpressing E. coli as well as the control cells. The pck overexpressing cells grew 22% slower than the ppc overexpressing cells. In a comparative transcriptome analysis of pck overexpressing cells and the ppc overexpressing cells, it was found that the genes concerning energy metabolism as well as building block biosynthesis were up-regulated. In addition, the pck overexpressing cells grown in complex medium revealed a remarkable up-regulation of genes on motility. The pck overexpression is proposed to be a better choice for cellular growth and biomolecular production since more energy could be produced when compared to the ppc overexpression. Therefore, protein expression was expected to be increased with the high generation of ATP through pck expression. The verification of the above theory is underway to reveal the relationship between the production of foreign protein and enhanced cellular ATP levels through pck expression. The fourth study included a tolerance enhancement against high succinic acid stress in E. coli. When succinic acid is accumulated high in the medium, the cell would experience unfavorable circumstances of low pH and high salt concentration. To investigate the physiology of the high succinic acid tolerant cell, a continuous culture was performed for 9 months under high succinic acid stress conditions. The final adapted strain was able to grow under 1.3 M succinic acid stress. The adapted regulations are under investigation and this would be beneficial for the development of a high tolerance strain via metabolic engineering. Altogether, this study provides a basal understanding of the regulation patterns of E. coli, which is beneficial for designing metabolic engineering strategies for C4 metabolite production using renewable resources.
Succinic acid is one of four-carbon dicarboxylic acid metabolites involved in the TCA cycle. It is used as a commercial chemical, food additive and precursor of vitamin B 12, hemoglobin, etc. Usually, it is produced from petrochemical-based maleic acid, but this process has the disadvantage of causing environmental pollution. Thus, many researchers have attempted to produce succinic acid using renewable resources. This study demonstrates the physiology of Escherichia coli (E. coli) during anaerobic fermentation to provide further environmentally safe strategies for the production of C4 metabolites. The first study conducted was the overexpression of gluconeogenic phophoenolpyruvate (PEP) carboxykinase of E. coli (pck_(EC)) among anaplerotic enzymes. Since succinic acid is synthesized by CO₂ fixation of C3 metabolites, supplementation of NaHCO₃or MgCO₃ enhanced the anaplerotic reaction. The overexpression of the pck_(EC) under anaerobic conditions enhanced succinic acid production as the NaHCO₃ concentration was increased. When 20 g/L of NaHCO₃ was added, succinic acid production in recombinant E. coli overexpressing PCK was 2.2-fold higher than that observed in the wild-type strain. It was concluded that the gluconeogenic pck_(EC) overexpression enabled E. coli to enhance succinic acid production only under high bicarbonate supplementation conditions. The second study involved an investigation into the formation of succinate through overexpression of various anaplerotic enzymes, including phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc), pyruvate carboxylase (pyc), NAD-dependent malic enzyme (maeA), and NADP-dependent malic enzyme (maeB), on E. coli. A remarkable increase in production of succinic acid was reported in E. coli overexpressing pck, maeB and ppc. The pck, maeB and ppc produced 18.1 mM, 15.4 mM and 11 mM of succinic acid, respectively, while the wild type produced 6.4 mM. The greatest increase in C4 metabolite ratio compared to the other tested enzymes was obtained with enhanced MaeB and Pck expression. The third study involved an investigation into the intracellular energy associated with pck and ppc expression. The gluconeogenic PCK and glycolytic PPC mediate the same reversible reactions of carboxylation of PEP (phosphoenopyruvate) into oxaloacetate. However, the PCK reaction produces one ATP molecule per one fixed carbon dioxide while the PPC reaction releases 1 mole of inorganic phosphate. The intracellular ATP levels were compared between E. coli overexpressing pck and ppc. The pck overexpressing E. coli was found to produce a 2-fold higher intracellular ATP pool than ppc overexpressing E. coli as well as the control cells. The pck overexpressing cells grew 22% slower than the ppc overexpressing cells. In a comparative transcriptome analysis of pck overexpressing cells and the ppc overexpressing cells, it was found that the genes concerning energy metabolism as well as building block biosynthesis were up-regulated. In addition, the pck overexpressing cells grown in complex medium revealed a remarkable up-regulation of genes on motility. The pck overexpression is proposed to be a better choice for cellular growth and biomolecular production since more energy could be produced when compared to the ppc overexpression. Therefore, protein expression was expected to be increased with the high generation of ATP through pck expression. The verification of the above theory is underway to reveal the relationship between the production of foreign protein and enhanced cellular ATP levels through pck expression. The fourth study included a tolerance enhancement against high succinic acid stress in E. coli. When succinic acid is accumulated high in the medium, the cell would experience unfavorable circumstances of low pH and high salt concentration. To investigate the physiology of the high succinic acid tolerant cell, a continuous culture was performed for 9 months under high succinic acid stress conditions. The final adapted strain was able to grow under 1.3 M succinic acid stress. The adapted regulations are under investigation and this would be beneficial for the development of a high tolerance strain via metabolic engineering. Altogether, this study provides a basal understanding of the regulation patterns of E. coli, which is beneficial for designing metabolic engineering strategies for C4 metabolite production using renewable resources.
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