착상 후 마우스 배아에서 Intracellular Superoxide Dismutases의 발현 및 조절 Expression and Regulation of Intracellular Superoxide Dismutases in Postimplantational Mouse Embryos원문보기
Superoxide dismutase (SOD)는 세포의 기능과 항상성을 유지하는 필수적인 항산화효소이지만, 배아에서의 발현과 역할은 명확하지 않다. 본 연구는 착상후 마우스 배아에서 intracellular SOD의 시기 및 조직별로 확인하고, 에탄올에 의해 유도된 기형모델에서 천연물에 대한 보호효과가 intracellular SOD을 통해서 이루어지는지 확인하였다. 또한, 다른 기형모델인 저산소증에서 기형이 intracellular SOD와 HIF-1a유전자의 감소와 ...
Superoxide dismutase (SOD)는 세포의 기능과 항상성을 유지하는 필수적인 항산화효소이지만, 배아에서의 발현과 역할은 명확하지 않다. 본 연구는 착상후 마우스 배아에서 intracellular SOD의 시기 및 조직별로 확인하고, 에탄올에 의해 유도된 기형모델에서 천연물에 대한 보호효과가 intracellular SOD을 통해서 이루어지는지 확인하였다. 또한, 다른 기형모델인 저산소증에서 기형이 intracellular SOD와 HIF-1a유전자의 감소와 항산화물질에 의한 보호효과를 관찰하였다. 마지막으로, intracellular SOD의 역할을 확인하기 위해 RNAi방법을 이용하였다. 첫번재 연구에서는 ICR 마우스를 교배시킨 후 암컷의 생식기 내에서 질전이 확인된 날을 배아기 0.5일로 하였다. 7.5일령에서 18.5일령까지의 배아를 채취하여 total RNA를 추출하여 cytoplasmic Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) 특이적인 Taqman primers를 이용하여 real-time PCR을 실시하였고, whole embryo 및 각각의 배아조직내에서 digoxigenin이 표식된 SOD1 riboprobe를 이용한 in situ hybridization 기법으로 SOD1 mRNA의 발현을 확인하였다. SOD1 mRNA는 배아기 7.5∼18.5일령에서 발현하였고, 배아기 12.5일에 가장 낮은 발현양상을 나타냈고 15.5일에는 가장 높은 양상을 보였다. In situ hybridization 분석결과, 7.5일령에서는 융모막 (chorion), 요막 (allantois), 양막 (amnion)과 신경주름(neural folds)에서 발현되었고, 8.5일령에서는 신경주름 (neural folds), 신경절 (neuromeres), 척삭 (notochord), 장관 (gut)과 원시선 (primitive streak)에서 발현되었다. 9.5~11.5일령에서는 중추신경계 (CNS)에서 발현이 높았지만 12.5일령에서는 약한 발현을 보였다. 9.5~12.5일령에서는 혀, 코, 눈와 귀 같은 감각기관에서의 발현이 높았지만 귀에서는 10.5일령 이후에 감소하였다. SOD1 mRNA는 9.5~11.5일령의 앞다리와 10.5~11.5일령의 뒷다리에서 높은 발현을 보였으며, 간에서는 11.5일령에서 높은 발현을 보였다. 심장과 생식융기 (genital eminence)에서는 11.5일령 이후에 발현이 증가되었다. 13.5~15.5일령에서 SOD1 mRNA는 CNS, 비강, 폐, 흉선, 췌장, 장, 신장과 부신에서 높게 발현되었지만, 간과 심장에서는 약한 발현을 보였다. 16.5일령이후에서도 다양한 장기에서 발현이 되었고, 특히 폐, 신장, 위, 소장과 같이 대사활동이 활발한 장기의 실질에서 그 발현이 강하게 나타났다. 또한, SOD1 mRNA는 상피세포, 수염모낭 (whisker follicles) 및 비강상피에서도 두드러지게 발현하였다. 두번째 연구에서는 동일한 방법으로 임신기를 확인하고, 배아 및 배체외조직 (extraembryonic tissue)을 시기별로 채취하여 SOD1 특이적인 항체를 이용하여 Western blotting과 면역염색을 실시하여 SOD1의 protein의 발현을 확인하였다. SOD1의 발현은 8.5∼18.5일령의 배아 및 배체외조직에서 확인되었다. 배아에서는, 9.5-11.5일에 가장 낮게 발현했고, 17.5-18.5일에 가장 높게 발현했지만, 배체외조직에서는 거의 비슷하게 발현하였다. 면역염색결과, SOD1 면역활성은 13.5-18.5일의 배아에서 발달동안 거의 대부분의 장기에서 발현했다. 특히, 맥락막 신경총의 상피, 신경절, 후각기의 감각세포, 청각상피, 혈액, 혈관, 간의 간세포와 조혈세포, 림프선, 연골조직과 피부에 두드러진 발현을 보였다. 세번째 연구에서는, Mitochondrial Mn SOD (SOD2) 특이적인 Taqman primers를 이용하여 real-time PCR을 실시하였고, digoxigenin이 표식된 SOD2 riboprobe를 이용한 in situ hybridization 기법으로 SOD2 mRNA의 발현을 확인하였다. 또한, SOD2 특이적인 항체를 이용하여 Western blotting과 면역염색을 실시하여 SOD2의 protein의 발현을 확인하였다. SOD2 mRNA의 발현은 배아기 7.5∼18.5일령에서 확인되었으며, 배아보다 태반을 포함한 배체외조직에서도 강하게 발현하였다. SOD2 mRNAs는 배아에서 발달동안 계속하여 증가했고, 태반을 포함한 배체외조직에서는 12.5일령까지 높게 발현되었지만, 13.5일령 이후로 감소하였다. SOD2의 단백질 양은 16.5일령까지 배아보다 배체외조직에서 높게 나타났지만, 17.5일령이후는 반대의 양상을 나타냈다. In situ hybridization 분석결과, SOD2 mRNA는 배아기 7.5일령에는 융모막, 요막, 외배엽, 신경주름에서 발현하였고, 8.5일령에는 신경주름, 신경절, 장관, 원시선에서 발현되었다. 배아기 9.5-12.5일령은 감각기관, 신경계, 사지말단에서 높게 나타났다. SOD2 mRNA는 13.5일과 14.5일령에서 간과 폐에서, 15.5일령 이후에는 뇌, 척수, 신경절, 피부, 혈구세포에서 강하게 발현하였다. SOD2 protein은 13.5일령부터 18.5일령까지 다양한 배아조직에서 발현되었다. 13.5일령부터 18.5일령에는 신경절, 심근, 혈관, 뼈발생 조직에서, 15.5일령 이후 맥락얼기, 척수, 감각기관의 상피, 장상피, 골격근, 갈색지방에서 강한 발현을 확인하였다. 본 연구결과, intracellular SOD는 착상후 기관형성동안 배아와 배아외 조직에서 시기 조직 특이적으로 발현되었고, 이는 배아발생동안 형성되는 내•외적으로 형성되는 산화스트레스에 대한 보호효과가 있음을 시사한다. 네번째 연구에서는, 다양한 천연물질이 에탄올에 의해 유도된 기형발생에 대한 보호효과가 intracellular SOD 발현의 변화를 통하여 이루어 지는지 전배아배양시스템을 이용하여 확인했다. 8.5일령의 배아는 에탄올과 함께, 흑삼, 캡사이신, 에모딘, 진저롤을 첨가하여 2일간 배양하였다. 에탄올에 노출된 배아의 SOD1 mRNA의 발현은 무처리 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었으나, SOD2 mRNA와 SOD activity는 무처리그룹에 비해 유의적으로 감소하였다. 그러나, 모든 천연물질을 첨가한 군에서 SOD2 mRNA 발현은 유의적으로 회복되었다. 게다가, SOD activity는 에탄올에 노출된 배아에 비해 흑삼과 캡사이신을 함께 첨가한 그룹에서 유의적으로 회복되었다. 다섯번째 연구에서는, 저산소 상태의 마우스 배아에서 에모딘, 진저롤, SOD 유사물질인 MnTBAP의 효과를 intracellular SODs와 HIF-1a 의 발현을 통해 알아보았다. 8.5일령의 배아를 저산소 조건 (5% O2) 에서 이틀간 배양하였을 때 yolk sac circulation, flexion, heart, brains, otic and optic systems, branchial bars, maxillary, mandibular processes 의 발달 장애를 보였으나, 에모딘, 진저롤, MnTBAP를 함께 처리한 군에서 유의적으로 회복되었다. SOD activity와 SOD1, SOD2, HIF-1a mRNA 의 발현은 저산소에 노출된 배아에서 유의적으로 감소하였으나, 위의 항산화물질을 함께 처리한 군에서 유의적으로 증가하였다. 본 연구결과, 다양한 항산화 물질은 에탄올과 저산소에 의해 유도된 기형발생에 보호효과가 SOD의 발현을 통해서 이루어지는 것을 확인하였다. 마지막으로, 마우스 배아의 중요한 기관발생기에 short hairpin 구조를 가진 lentiviral vector를 이용하여 영향을 확인하기 위해, 전배아배양법을 이용하여 SOD1과 SOD2를 targeting 을 위해 5개의 plasmid를 이용하였다. 8.5일 배아는 양막에 미세주입기를 이용하여 LV-SOD1과 LV-SOD2를 주입하여, 전배아배양법으로 이틀간 배양하였다. LV-SOD1을 주입한 배아에서 SOD1 mRNA와 단백질발현이 LV construct만 주입한 대조그룹에 비해 각각 41%와 65%로 유의적으로 감소하였다. 또한 LV-SOD2을 주입한 배아에서 SOD2 mRNA와 단백질발현은 대조그룹에 비해 각각 54%와 43%로 유의적으로 감소하였다. LV-SOD1 과 LV-SOD2는 정상 그룹에 비해 성장지연을 보였다. Intracellular SOD가 knockdown된 배아에서 불완전한 양막의 혈관형성, 불규칙한 뇌의 형성, 신경관의 지그재그 형태, 안면기형, 심장부종이 관찰되었다. 연구결과, intracellular SOD 는 마우스 기관발생에 필수적이며, 이 방법은 초기 기관발생에 관련된 유전자의 기능과 조절 규명에 유용한 방법으로 사용될 것으로 사료된다.
Superoxide dismutase (SOD)는 세포의 기능과 항상성을 유지하는 필수적인 항산화효소이지만, 배아에서의 발현과 역할은 명확하지 않다. 본 연구는 착상후 마우스 배아에서 intracellular SOD의 시기 및 조직별로 확인하고, 에탄올에 의해 유도된 기형모델에서 천연물에 대한 보호효과가 intracellular SOD을 통해서 이루어지는지 확인하였다. 또한, 다른 기형모델인 저산소증에서 기형이 intracellular SOD와 HIF-1a유전자의 감소와 항산화물질에 의한 보호효과를 관찰하였다. 마지막으로, intracellular SOD의 역할을 확인하기 위해 RNAi방법을 이용하였다. 첫번재 연구에서는 ICR 마우스를 교배시킨 후 암컷의 생식기 내에서 질전이 확인된 날을 배아기 0.5일로 하였다. 7.5일령에서 18.5일령까지의 배아를 채취하여 total RNA를 추출하여 cytoplasmic Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) 특이적인 Taqman primers를 이용하여 real-time PCR을 실시하였고, whole embryo 및 각각의 배아조직내에서 digoxigenin이 표식된 SOD1 riboprobe를 이용한 in situ hybridization 기법으로 SOD1 mRNA의 발현을 확인하였다. SOD1 mRNA는 배아기 7.5∼18.5일령에서 발현하였고, 배아기 12.5일에 가장 낮은 발현양상을 나타냈고 15.5일에는 가장 높은 양상을 보였다. In situ hybridization 분석결과, 7.5일령에서는 융모막 (chorion), 요막 (allantois), 양막 (amnion)과 신경주름(neural folds)에서 발현되었고, 8.5일령에서는 신경주름 (neural folds), 신경절 (neuromeres), 척삭 (notochord), 장관 (gut)과 원시선 (primitive streak)에서 발현되었다. 9.5~11.5일령에서는 중추신경계 (CNS)에서 발현이 높았지만 12.5일령에서는 약한 발현을 보였다. 9.5~12.5일령에서는 혀, 코, 눈와 귀 같은 감각기관에서의 발현이 높았지만 귀에서는 10.5일령 이후에 감소하였다. SOD1 mRNA는 9.5~11.5일령의 앞다리와 10.5~11.5일령의 뒷다리에서 높은 발현을 보였으며, 간에서는 11.5일령에서 높은 발현을 보였다. 심장과 생식융기 (genital eminence)에서는 11.5일령 이후에 발현이 증가되었다. 13.5~15.5일령에서 SOD1 mRNA는 CNS, 비강, 폐, 흉선, 췌장, 장, 신장과 부신에서 높게 발현되었지만, 간과 심장에서는 약한 발현을 보였다. 16.5일령이후에서도 다양한 장기에서 발현이 되었고, 특히 폐, 신장, 위, 소장과 같이 대사활동이 활발한 장기의 실질에서 그 발현이 강하게 나타났다. 또한, SOD1 mRNA는 상피세포, 수염모낭 (whisker follicles) 및 비강상피에서도 두드러지게 발현하였다. 두번째 연구에서는 동일한 방법으로 임신기를 확인하고, 배아 및 배체외조직 (extraembryonic tissue)을 시기별로 채취하여 SOD1 특이적인 항체를 이용하여 Western blotting과 면역염색을 실시하여 SOD1의 protein의 발현을 확인하였다. SOD1의 발현은 8.5∼18.5일령의 배아 및 배체외조직에서 확인되었다. 배아에서는, 9.5-11.5일에 가장 낮게 발현했고, 17.5-18.5일에 가장 높게 발현했지만, 배체외조직에서는 거의 비슷하게 발현하였다. 면역염색결과, SOD1 면역활성은 13.5-18.5일의 배아에서 발달동안 거의 대부분의 장기에서 발현했다. 특히, 맥락막 신경총의 상피, 신경절, 후각기의 감각세포, 청각상피, 혈액, 혈관, 간의 간세포와 조혈세포, 림프선, 연골조직과 피부에 두드러진 발현을 보였다. 세번째 연구에서는, Mitochondrial Mn SOD (SOD2) 특이적인 Taqman primers를 이용하여 real-time PCR을 실시하였고, digoxigenin이 표식된 SOD2 riboprobe를 이용한 in situ hybridization 기법으로 SOD2 mRNA의 발현을 확인하였다. 또한, SOD2 특이적인 항체를 이용하여 Western blotting과 면역염색을 실시하여 SOD2의 protein의 발현을 확인하였다. SOD2 mRNA의 발현은 배아기 7.5∼18.5일령에서 확인되었으며, 배아보다 태반을 포함한 배체외조직에서도 강하게 발현하였다. SOD2 mRNAs는 배아에서 발달동안 계속하여 증가했고, 태반을 포함한 배체외조직에서는 12.5일령까지 높게 발현되었지만, 13.5일령 이후로 감소하였다. SOD2의 단백질 양은 16.5일령까지 배아보다 배체외조직에서 높게 나타났지만, 17.5일령이후는 반대의 양상을 나타냈다. In situ hybridization 분석결과, SOD2 mRNA는 배아기 7.5일령에는 융모막, 요막, 외배엽, 신경주름에서 발현하였고, 8.5일령에는 신경주름, 신경절, 장관, 원시선에서 발현되었다. 배아기 9.5-12.5일령은 감각기관, 신경계, 사지말단에서 높게 나타났다. SOD2 mRNA는 13.5일과 14.5일령에서 간과 폐에서, 15.5일령 이후에는 뇌, 척수, 신경절, 피부, 혈구세포에서 강하게 발현하였다. SOD2 protein은 13.5일령부터 18.5일령까지 다양한 배아조직에서 발현되었다. 13.5일령부터 18.5일령에는 신경절, 심근, 혈관, 뼈발생 조직에서, 15.5일령 이후 맥락얼기, 척수, 감각기관의 상피, 장상피, 골격근, 갈색지방에서 강한 발현을 확인하였다. 본 연구결과, intracellular SOD는 착상후 기관형성동안 배아와 배아외 조직에서 시기 조직 특이적으로 발현되었고, 이는 배아발생동안 형성되는 내•외적으로 형성되는 산화스트레스에 대한 보호효과가 있음을 시사한다. 네번째 연구에서는, 다양한 천연물질이 에탄올에 의해 유도된 기형발생에 대한 보호효과가 intracellular SOD 발현의 변화를 통하여 이루어 지는지 전배아배양시스템을 이용하여 확인했다. 8.5일령의 배아는 에탄올과 함께, 흑삼, 캡사이신, 에모딘, 진저롤을 첨가하여 2일간 배양하였다. 에탄올에 노출된 배아의 SOD1 mRNA의 발현은 무처리 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었으나, SOD2 mRNA와 SOD activity는 무처리그룹에 비해 유의적으로 감소하였다. 그러나, 모든 천연물질을 첨가한 군에서 SOD2 mRNA 발현은 유의적으로 회복되었다. 게다가, SOD activity는 에탄올에 노출된 배아에 비해 흑삼과 캡사이신을 함께 첨가한 그룹에서 유의적으로 회복되었다. 다섯번째 연구에서는, 저산소 상태의 마우스 배아에서 에모딘, 진저롤, SOD 유사물질인 MnTBAP의 효과를 intracellular SODs와 HIF-1a 의 발현을 통해 알아보았다. 8.5일령의 배아를 저산소 조건 (5% O2) 에서 이틀간 배양하였을 때 yolk sac circulation, flexion, heart, brains, otic and optic systems, branchial bars, maxillary, mandibular processes 의 발달 장애를 보였으나, 에모딘, 진저롤, MnTBAP를 함께 처리한 군에서 유의적으로 회복되었다. SOD activity와 SOD1, SOD2, HIF-1a mRNA 의 발현은 저산소에 노출된 배아에서 유의적으로 감소하였으나, 위의 항산화물질을 함께 처리한 군에서 유의적으로 증가하였다. 본 연구결과, 다양한 항산화 물질은 에탄올과 저산소에 의해 유도된 기형발생에 보호효과가 SOD의 발현을 통해서 이루어지는 것을 확인하였다. 마지막으로, 마우스 배아의 중요한 기관발생기에 short hairpin 구조를 가진 lentiviral vector를 이용하여 영향을 확인하기 위해, 전배아배양법을 이용하여 SOD1과 SOD2를 targeting 을 위해 5개의 plasmid를 이용하였다. 8.5일 배아는 양막에 미세주입기를 이용하여 LV-SOD1과 LV-SOD2를 주입하여, 전배아배양법으로 이틀간 배양하였다. LV-SOD1을 주입한 배아에서 SOD1 mRNA와 단백질발현이 LV construct만 주입한 대조그룹에 비해 각각 41%와 65%로 유의적으로 감소하였다. 또한 LV-SOD2을 주입한 배아에서 SOD2 mRNA와 단백질발현은 대조그룹에 비해 각각 54%와 43%로 유의적으로 감소하였다. LV-SOD1 과 LV-SOD2는 정상 그룹에 비해 성장지연을 보였다. Intracellular SOD가 knockdown된 배아에서 불완전한 양막의 혈관형성, 불규칙한 뇌의 형성, 신경관의 지그재그 형태, 안면기형, 심장부종이 관찰되었다. 연구결과, intracellular SOD 는 마우스 기관발생에 필수적이며, 이 방법은 초기 기관발생에 관련된 유전자의 기능과 조절 규명에 유용한 방법으로 사용될 것으로 사료된다.
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